胶乳是巴西橡胶树(Heveabrasiliensis)割胶后从乳管细胞(一种产胶组织)中流出的白色胶态悬浮液,是天然橡胶的主要来源。橡胶粒子是橡胶树乳管细胞中的一种特殊细胞器,是橡胶生物合成及橡胶贮藏的场所。橡胶延伸因子(REF)是橡胶粒子中高丰度表达的一类蛋白,与橡胶转移酶、小橡胶粒子蛋白(SRPP)以及其他种类的蛋白因子可能通过蛋白间相互作用,形成蛋白复合体催化橡胶生物合成。REF和SRPP在橡胶生物合成中发挥重要作用,然而对于REF和SRPP在天然橡胶合成中的具体功能以及REF家族中不同REF基因之间的功能相关性尚不明确。因此,对REF家族中不同成员基因的研究将有助于探明REF家族在橡胶生物合成中的作用,从而揭示天然橡胶生物合成及其调控的分子机制,为进一步改良橡胶树的产胶性状及提高其产量奠定基础。本研究选用巴西橡胶树无性系热研7-33-97为实验材料,克隆了 REF家族新成员HbREF3基因,在此基础上,对HbREF3进行了基因表达和亚细胞定位分析,并筛选鉴定了与之相互作用的候选蛋白因子,主要研究结果如下:1、本研究在橡胶粒子蛋白质组分析鉴定出1个橡胶延长因子REF家族新成员HbREF3的基础上,克隆了 HbREF3基因的cDNA序列。HbREF3基因全长1296 bp,具有一个672 bp的开放阅读框(ORF),编码223个氨基酸,分子量约为24.7 KDa。2、通过实时荧光定量PCR技术对HbREF3基因进行了表达分析,结果表明,HbREF3基因在橡胶树多个组织中均有表达,在胶乳中的表达量最高;外源乙烯与茉莉酸及割胶刺激均能诱导HbREF3基因的上调表达。3、构建pEASY-El-HbREF3原核表达载体,在大肠杆菌BL21中诱导表达,得到的诱导蛋白与HbREF3蛋白预测大小一致。利用原核表达HbREF3蛋白为抗原制备抗体,通过SDS-PAGE电泳分析和Western-blot检测,结果表明,HbREF3在大、小橡胶粒子上都有表达,且在小橡胶粒子中的表达量略大于大橡胶粒子。4、将HbREF3及与HbREF3高度同源的拟南芥REF基因(AtREF)和烟草REF基因(NtREF)编码区插入到植物表达载体pCAMBIA1300,与载体中的绿色荧光蛋白(GFP)分别形成HbREF3:GFP,AtREF:GFP和NtREF:GFP融合表达蛋白,并将融合表达蛋白和GFP对照转化至水稻原生质体中进行亚细胞定位分析。结果表明,HbREF3,AtREF和NtREF这3个不同物种的REF蛋白均定位于水稻原生质体的细胞核。5、为了筛选鉴定胶乳cDNA文库中与HbREF3互作的候选蛋白,根据HbREF3保守结构域分别将HbREF3-F(含全长ORF序列),HbREF3-N(含N端序列)和HbREF3-C(含C端序列)构建到载体pGBKT7,分别得到诱饵表达载体pGBKT7-HbREF3-F,pGBKT7-HbREF3-N 和 pGBKT7-HbREF3-C,通过酵母双杂交实验共筛选到10个HbREF3的候选互作蛋白。将各诱饵蛋白与筛选到的候选互作蛋白进行酵母共转化验证,结果表明,5个候选互作蛋白(分别是HbREF1、SRPP、RAB、HEV1和UDP葡萄糖转移酶)与HbREF3的N-端与C-端结构域具有相互作用。