细胞骨架是组成细胞结构体系之一。主要分为:微管、微丝、中间纤维三种类型。在细胞的运动和形态改变中,微丝发挥了重要作用。尤其是在肿瘤细胞的侵袭转移过程中,细胞骨架的重排是侵袭转移等肿瘤恶性行为发生的必要条件。肿瘤细胞的细胞骨架骨架的形成是以vinculin为标志蛋白,并调节黏着斑(Focal adhesion,FA)的形成。黏着斑的大约由几十种蛋白组成,常见的有integrin、FAK、talin、paxillin、vitronectin、actin等。HAb18G/CD147(CD147)是细胞表面的糖基化单次跨膜蛋白,属于免疫球蛋白超家族成员,是肿瘤侵袭和转移的标志性分子,不良预后的标志物。之前的大量研究已经发现CD147能够影响肝癌细胞骨架重排。但CD147调节细胞骨架的机制尚不清楚。为了研究CD147高表达调节肝癌细胞侵袭转移和影响细胞骨架重排的机制。我们采用分子生物学方法western blot,荧光报告基因,结合细胞水平下激光共聚焦观察细胞形态,骨架染色、黏着斑荧光漂白恢复FRAP、荧光能量共振转移FRET等新方法,对细胞骨架和运动相关功能进行检测。结果显示CD147参与了vinculin介导的黏着斑蛋白复合物的形成,动态调节其聚合和解离。通过和标志性蛋白vinculin的直接相互作用影响黏着斑的面积和强度,从而导致了细胞骨架的重排。第一部分:CD147调节vinculin的表达及其相互作用K7721细胞系是在之前SMMC-7721肝癌细胞系的基础上,对CD147分子进行敲除,经过筛选得到的稳定细胞系。在K7721细胞的基础上我们又稳定转染pc DNA3.1-CD147质粒,筛选并获得回复CD147表达的细胞系R7721。细胞系T7721细胞是本实验室先前构建的SMMC-7721过表达CD147的肝癌细胞系。我们将对这四株细胞系中CD147和vinculin的表达量进行检测。采用si RNA分别干涉CD147和vinculin的方法检测蛋白表达的相互调控。免疫荧光染色的方法观察细胞内CD147和vinculin的定位关系,免疫共沉淀采用用本室自制的CD147抗体,vinculin抗体,mouse-Ig G对树脂柱进行处理,之后用western blot的方法检测SMMC-7721细胞株裂解液是否存在结合。最后我们分别构建了p EGFP-CD147、Dsred2-N1-vinculin的携带荧光蛋白的质粒,分别转染SMMC-7721细胞,并采用共转染的方法将两种质粒转入同一细胞中,使用激光共聚焦,观察FRET现象说明其二者发生相互作用发生在小于10nm的距离。实验结果显示,si RNA干涉CD147,使CD147和vinculin的表达量同时下调,而对vinculin的干涉,没有发现CD147表达量的变化。在对四株肝癌细胞系中CD147和vinculin的表达量进行检测时发现,在K7721细胞中,vinculin的表达显著上调,而在高表达CD147的SMMC-7721、R7721、T7721细胞中,vinculin的表达量很低。免疫共沉淀结果显示,在SMMC-7721细胞裂解液中,CD147和vinculin存在结合。之后使用荧光标签的质粒进行FRET实验,共转p EGFP-CD147和Dsred2-N1-vinculin两种质粒的细胞发生了FRET现象,并且在黏着斑的位置这种相互作用较强。以上结果提示CD147与vinculin存在相互作用。第二部分:不同细胞系内黏着斑及骨架的观察Vinculin是构成黏着斑(Focal Adhesion)的主要蛋白,大量的报道证实:vinculin和actin存在直接结合,因此通过vinculin可以直接调节细胞骨架的形成。由于四株细胞系CD147的表达水平不同,观察vinculin为主导的黏着斑的面积、强度、圆度、直径等参数,可以明确CD147的表达对以vinculin为标志的黏着斑的影响。与此同时我们用鬼笔环肽对细胞的骨架进行染色观察,发现四株细胞系各自不相同的黏着斑的参数,和细胞骨架的组织形式,对这些数据进行统计学处理,寻找相互的关系,从而明确CD147通过黏着斑影响细胞骨架,对肝癌细胞的黏附和运动状态产生重要作用。黏附作为一种定向运动必需的重要步骤之一,需要黏着斑的组装和解离,在这个过程中拉伸细胞骨架,在肌球蛋白等的作用下,细胞的前端不断形成点状的FA,而细胞后部的FA不断的解离,细胞就在黏着斑不断动态组装和解离的过程中,产生定向运动。因此CD147对黏着斑的调节最终影响的是细胞的运动过程。由于FA的形成是一个动态过程,我们采用了荧光漂白回复的方法,构建p EYFP-vinculin的质粒,分别转入四株细胞系,在活细胞状态下,采用激光共聚焦488nm的激光100%功率漂白vinculin在细胞膜上形成的黏着斑,同时观察其回复的时间,之后对数据进行处理,代入数学模型公式进行计算得到解离常数。对四种细胞骨架和黏着斑的观察结果显示,SMMC-7721细胞的黏着斑的平均强度大于其他三种细胞,这说明细胞在相同的黏着斑面积下聚集了更多的vinculin蛋白参与组装,其细胞骨架清晰可见,排列集中,但存在随细胞边缘变化的自然弯曲。在敲除CD147的K7721细胞中,细胞骨架排列紊乱松散,没有明显的微丝束,存在更多的细小分支分布于细胞边缘。R7721回复后,发现细胞呈线性排列,黏着斑分部在骨架两端,其面积和强度较SMMC-7721细胞都有一定程度的减少。T7721的细胞骨架相比于其他细胞比较短小,但黏着斑分部广泛,到达了细胞的中心位置。FRAP的结果同样发现,四株细胞具有完全不同的结合和解离常数。纯数学结合模型的方程拟合SMMC-7721细胞的vinculin回复曲线残差更小,并且经计算,其解离常数的数值最大。第三部分:CD147对细胞黏附和铺展及细胞形态的影响黏着斑是细胞黏附于细胞外基质的重要方式,当细胞外基质不同时,存在不同的黏附方式,其黏附力的提供也有所不同。本文采用matrigel作为细胞基质预处理培养皿,4℃过夜。细胞铺展实验中,我们采用matrigel胶作为细胞外ECM包被培养板,将消化下来的细胞重悬于无血清培养基,转入包被后的培养板中,在15分钟的间隔时段,以激光共聚焦微分干涉相差显微镜(DICM)观察细胞形态。细胞铺展实验结果显示:细胞铺展速度与黏着斑的生成和聚集程度有重要的相互联系。在对四株细胞铺展的过程观察发现,SMCC-7721、R7721和T7721具有较大的黏着斑,能较快地黏附于matrigel预处理的培养皿底面。而在K7721细胞中由于CD147的敲除,黏着斑蛋白vinculin的荧光信号微弱,长时间内细胞无法贴壁,铺展的过程十分缓慢。在细胞形态方面T7721细胞是以明显的丝状伪足来铺展的,而SMMC-7721的铺展方式是板状伪足。黏着斑的观察结果显示,T7721细胞的黏着斑在细胞底面的整个区域都有分布,而在SMMC-7721、R7721细胞中,黏着斑的生成随着细胞贴壁面积的扩大,会向细胞边缘聚集,而未见黏着斑在细胞中心位置的分布。