目的:膀胱癌（bladder cancer,BCa）是人类泌尿系统中最常见的肿瘤之一。在临床上,膀胱癌最常见的治疗方法是手术治疗联合术后膀胱灌注化疗,但药物治疗后复发率较高,且复发后对其他多种化疗药物亦产生耐受,致使患者预后变差。这对患者家庭经济与精神情况造成困扰,是目前膀胱癌临床治疗亟需攻克的难题之一。肿瘤的多药耐药（multi-drug resistance,MDR）是近年来医学领域研究热点之一,许多引起肿瘤MDR的关键因子及通路被发现,然而目前为止有关于膀胱癌细胞多药耐药性的相关机制研究非常少见。因此,明确膀胱癌MDR的发生机制,找到干预的手段从而降低肿瘤治疗后复发率,提升患者预后,是本研究的首要目标。研究方法:1.膀胱癌多药耐药细胞系的构建及鉴定选取2株常见膀胱肿瘤细胞系作为普通敏感细胞株,通过大剂量及小剂量药物冲击法分别逐步构建相对应的膀胱癌多药耐药细胞系,挑选培养效果最佳的细胞系参与后续实验。通过测定细胞系对临床常见膀胱癌灌注治疗药物的半抑制浓度（50%maximum inhibitory concentration,IC50）,验证所构建的多药耐药细胞系相比普通细胞系的细胞多药耐药性差异。2.转录组学芯片分析结果结合公共数据库信息分析并筛选差异基因分别提取膀胱癌普通细胞系和多药耐药细胞系的总RNA,使用Affymetrix HTA 2.0 Array进行转录组学芯片分析。按照Fold change值排序筛选出差异最为显著的10个上调基因作为候选差异基因用于后续研究。应用ONCOMINE等互联网公共数据库,统计10个候选差异基因在膀胱肿瘤以及正常膀胱组织中表达水平的对比情况,以及差异基因的表达对膀胱肿瘤的复发率、进展等情况的影响,再通过统计学分析筛选出表达差异最大、与膀胱癌复发率相关性最佳的两个因子,作为后续研究目标。3.生物信息学方法分析目的因子在泛癌中的表达和作用结合TCGA等互联网公共数据库数据,对两个关键因子在泛癌组织和细胞系中的表达情况,以及其对各类型肿瘤样本的预后、免疫浸润、DNA修复与修饰等情况的影响进行罗列、统计并可视化,进一步阐明上述两个关键因子在人体疾病中的作用,为其在膀胱肿瘤中的作用研究奠定基础。4.验证关键因子的表达及对多药耐药细胞株细胞性质的影响首先通过PCR实验和免疫印迹实验验证普通细胞株与多药耐药细胞株中,上述两个关键因子表达水平的差异是否与测序结果一致;再通过RNAi技术敲减多药耐药细胞株中两个因子,验证转染效率后,通过测定细胞的多药耐药性,来验证在改变关键因子表达水平后,细胞的多药耐药性随之产生的影响。并选取实验结果更明显的因子进行后续机制研究。5.体内体外实验探索目的因子对膀胱癌细胞多药耐药性的详细作用机制通过过表达或敲减普通膀胱癌细胞中目的因子的表达水平,验证转染效率后,检测目的因子表达水平的变化对细胞多药耐药性、细胞凋亡及相关关键因子表达水平所产生的影响。与多药耐药细胞系的实验结果进行对比探讨。通过小鼠成瘤实验,验证在动物体内化疗药物作用下,膀胱癌细胞成瘤的体积及重量,随目的因子表达水平的不同而产生的变化。通过Co IP实验验证目的因子与主要关联因子之间的相互结合作用,并通过细胞核蛋白与细胞浆蛋白的抽提及检测实验,测定目的因子在不同种细胞中的细胞亚定位,并结合药物细胞毒性测定实验,探讨目的因子对膀胱癌细胞多药耐药性的具体作用机制。结果:1.选取2株常见膀胱肿瘤细胞系,通过小剂量药物冲击法成功培养并构建出膀胱癌多药耐药细胞系（T24-THP）。经过其对吡柔比星（pirarubicin,THP）、表柔比星（epirubicin,EPI）、丝裂霉素c（mitomycin c,MMC）三种药物IC50的检测,结果显示多药耐药细胞系相较于普通细胞系,具有增强的多药耐药性。2.经过转录组学芯片测序结果分析发现,两组细胞系存在10个表达显著上调的差异基因,他们分别是:RSAD2、HERC5、HERC6、HIST1H2AC、STAT1、IFIT1、MX1、IFIT2、IFI6、XAF1。3.结合TCGA、ONCOMINE等互联网公共数据库,在10个表达上调的差异基因中筛选出2个关键基因:XAF1（X chromosome-linked inhibitor of apoptosis protein associated factor 1,X染色体连锁凋亡蛋白抑制基因相关因子1）、IFI6（interferon alpha inducible protein 6,干扰素α诱导蛋白6）,并发现其与膀胱癌患者的复发情况及肿瘤进展情况密切相关。通过泛癌分析还可知,与正常组织或细胞相比,IFI6、XAF1在多种肿瘤组织及细胞中表达水平明显改变,且在癌症预后、免疫、DNA修复及修饰等细胞表型和生物活动中产生效应。之后,通过干扰两个因子的表达并对细胞多药耐药性进行验证,最终确定发挥功能更明显的基因XAF1作为目的基因进行后续实验。4.体外实验及体内成瘤实验证明,在普通膀胱癌细胞系T24及UMUC3中,目的因子XAF1表达水平的改变对细胞凋亡、细胞多药耐药性造成的影响,与多药耐药细胞系T24-THP完全相反。细胞中凋亡相关关键效应蛋白与细胞多药耐药性变化趋势一致,说明XAF1通过调节细胞凋亡相关因子影响膀胱癌细胞多药耐药性。5.通过免疫共沉淀实验发现XAF1与凋亡关键因子XIAP（X chromosomelinked inhibitor of apoptosis protein,X染色体连锁凋亡蛋白抑制基因）结合仍然稳定,在T24-THP细胞中未发生脱靶改变。再通过细胞浆蛋白与细胞核蛋白的分离提取检测,发现,T24细胞中,XAF1定位于细胞核内;T24-THP细胞中,XAF1则主要定位于细胞质中。细胞核内XAF1高表达,结合更多XIAP聚集于细胞核中,使其无法在胞质中发挥对细胞凋亡的抑制作用,导致细胞不耐药发生凋亡;细胞质中XAF1高表达,不改变细胞质中XIAP的含量,其凋亡抑制作用不受影响。当T24-THP细胞质中XAF1表达量下降,XIAP因XAF1表达量的核质比改变而重新分布,使细胞核中XIAP分布量增高、细胞质中XIAP分布量减少,进而使细胞发生凋亡,多药耐药性降低。6.当加入化疗药物时,短期内T24细胞核内XAF1内源性表达升高,并促使XIAP进入细胞核,从而促进细胞凋亡发生;而T24-THP细胞可以短期内抵抗化疗药物引起的XAF1内源性表达升高,一定程度上抑制细胞凋亡,使T24-THP细胞耐药。结论:XAF1是肿瘤细胞中常见的凋亡相关蛋白,可以与XIAP因子结合并拮抗其抗凋亡作用。与普通膀胱癌T24细胞系相比,膀胱癌多药耐药细胞系T24-THP中XAF1表达水平显著升高,而其表达水平的改变在两种细胞系中所引起的细胞凋亡与细胞多药耐药性变化趋势完全相反。药物长期诱导会使多药耐药细胞系T24-THP中XAF1的表达定位从细胞核中转移至细胞质内,从而改变细胞中XIAP的表达分布,进而使细胞凋亡受抑制、细胞多药耐药性升高。T24-THP细胞系还可以抵抗短期化疗药物引起的XAF1内源性表达升高,从而使细胞耐药。