肽基-脯氨酰基顺反异构酶（peptidyl-prolyl cis-trans isomerase,Pin1）在多种肿瘤中异常激活,通过作用于其底物或相关信号通路促进肿瘤发生发展。宫颈上皮内瘤变（squamous intraepithelial lesions,SIL）属于癌前病变。低级别宫颈上皮内瘤变（Low-grade squamous intraepithelial lesions,LSIL）预后良好,但LSIL进展为高级别宫颈上皮内瘤变（High-grade squamous intraepithelial lesions,HSIL）极大增加宫颈癌患病风险,目前尚缺乏有效风险评估的指标。由于Pin1在肿瘤起始阶段的独特作用,在癌前病变阶段检测Pin1的表达作为发癌前病变阶段的风险分层指标具有重要意义。宫颈癌转移及化学敏感性降低是导致治疗失败的主要原因。Pin1一方面能够与下游底物c-Jun、AKT、cyclinD1、β-catenin和STAT3等结合,催化顺反异构变化,调控下游靶点。另一方面通过激活下游多种致癌基因和生长促进剂,在肿瘤发生发展中发挥重要促癌作用。靶向Pin1的治疗在人急性早幼粒白血病、肝癌和乳腺癌等肿瘤中发挥良好效果。Pin1抑制剂可以显著抑制Pin1的致癌作用。目前常见的Pin1抑制剂由于非共价结合等原因存在结合能力差、大量脱靶效应及生物安全性低等缺点,无法用于体内实验。根据Elena Campaner等人的研究,我们合成了新型Pin1特异性抑制剂,可以与Pin1共价结合导致Pin1降解,具有高度靶向性,并且对非肿瘤细胞影响较小,具有良好转化前景。顺铂是我国宫颈癌治疗的一线化疗药物,存在高剂量下的副作用及顺铂敏感性降低等问题。探讨KPT-6566与顺铂联合应用的可行性,可为临床宫颈癌用药提供新思路。目前有关Pin1在宫颈癌发生发展过程中相关研究较少。本课题拟检查Pin1在宫颈SIL及宫颈癌组织中表达,分析LSIL风险分层及临床意义;研究Pin1对宫颈癌细胞增殖和转移的作用,以评估Pin1及治疗靶点的可能性;探讨KPT-6566提高顺铂疗效的可行性,为宫颈癌诊断与治疗方法的改善提供理论和实验依据。方法:1.Pin1和c-Jun在宫颈SIL与宫颈癌组织中的表达及临床意义（1）Pin1和c-Jun在宫颈SIL组织中的表达及临床意义:免疫组织化学染色法检测Pin1和c-Jun在72例SIL组织中的表达,并分析与LSIL进展的关系,以及Pin1和c-Jun表达的相关性。（2）Pin1和c-Jun在宫颈癌组织中的表达及临床意义:免疫组织化学染色法检测Pin1和c-Jun在28例宫颈癌组织中的表达,分析与患者临床参数的关系以及二者之间表达的相关性。Western Blot进一步验证12例不同分期宫颈癌组织Pin1和c-Jun表达水平。2.抑制Pin1体系的建立及鉴定（1）宫颈癌Hela和Siha细胞系中沉默Pin1并获得稳定细胞株:使用脂质体法在Hela和Siha细胞中沉默Pin1,建立Hela-shPin1和Siha-shPin1细胞系,并通过RT-PCR和Western Blot方法进行鉴定。（2）合成和鉴定新型Pin1抑制剂KPT-6566:化学合成KPT-6566,并通过质谱和核磁共振氢谱法鉴定化合物分子量及化学结构。（3）KPT-6566抑制Pin1及相关蛋白表达:Western blot检测KPT-6566处理Hela和Siha细胞后Pin1及其相关信号通路与部分底物蛋白表达。3.Pin1作为宫颈癌治疗靶点的研究（1）沉默Pin1对细胞增殖能力的影响:CCK8细胞活力检测实验,二维克隆集落形成实验检测沉默Pin1对Hela和Siha细胞增殖的作用。（2）沉默Pin1对细胞迁移侵袭的作用:细胞划痕实验和Transwell侵袭实验检测沉默Pin1对Hela和Siha细胞迁移和侵袭能力的影响。裸鼠肝转移模型观察抑制Pin1表达对宫颈癌细胞转移能力的影响。（3）Pin1对EMT的影响:Western blot检测Pin1底物c-Jun、Slug、E-cadherin、N-cadherin和Vimentin等蛋白表达。Hela-shPin1与Siha-shPin1细胞系中过表达c-Jun,Western Blot检测EMT相关蛋白表达。4.KPT-6566对宫颈癌细胞顺铂杀伤效果的影响（1）KPT-6566影响顺铂对细胞的杀伤效果:透射电镜观察KPT-6566和顺铂处理后Hela和Siha细胞超微形态结构;流式细胞术检测细胞凋亡;Western Blot检测细胞凋亡相关蛋白cleaved-caspase3和cleaved-PARP表达水平。（2）KPT-6566对裸鼠异种移植瘤模型中顺铂抗肿瘤作用的影响:裸鼠异种移植瘤实验检测KPT-6566联合顺铂对宫颈癌细胞体内移植瘤生长能力的影响;免疫组织化学染色检测移植瘤组织Pin1表达;TUNEL实验检测移植瘤组织中细胞凋亡。H&E染色观察异种移植瘤组织和小鼠心、肝、脾、肺和肾的组织结构。结果:1.Pin1和c-Jun在宫颈SIL组织与宫颈癌组织中的表达及临床意义（1）Pin1和c-Jun在宫颈SIL组织中的表达与临床意义:72例LSIL中Pin1阳性35例,其中14例进展为高级别（40%）;Pin1阴性37例,其中3例进展为HSIL（8%）;Pin1表达与LSIL至HSIL的进展有关（P=0.001）。以上结果提示,Pin1可以作为判断LSIL进展的指标。72例LSIL组织中c-Jun阴性25例,其中5例进展为HSIL;47例c-Jun阳性的LSIL组织中,有12例进展为HSIL（25%）。以上结果表明,c-Jun表达与LSIL至HSIL的进展无关（P=0.599）。LSIL组织中,Pin1和c-Jun表达水平呈正相关,提示Pin1和可能存在调控关系,影响LSIL病情进展。（2）Pin1和c-Jun在宫颈癌组织中的表达及临床意义:28例宫颈癌组织中Pin1阳性18例,阴性10例,Pin1表达与宫颈癌淋巴结转移有关（P=0.039）,与增值指数Ki67有关（P=0.014）;与宫颈癌患者年龄、肿瘤大小无关。28例宫颈癌组织中c-Jun阳性26例,阴性2例,c-Jun表达与宫颈癌增殖指数Ki67有关,与宫颈癌患者年龄、淋巴结转移和肿瘤体积无关。免疫组织化学染色结果相关性显示,宫颈癌组织中,Pin1与c-Jun表达水平呈正相关（P=0.049）,提示Pin1和可能存在调控关系,影响宫颈癌病情进展。Western Blot结果显示,宫颈癌组织中Pin1和与c-Jun蛋白表达水平显著高于宫颈炎症组织。以上结果提示,Pin1可以作为判断LSIL进展的指标;宫颈癌组织中Pin1异常表达可能与宫颈癌细胞的增殖和转移等恶性表型有关。2.沉默Pin1体系的建立及鉴定（1）Hela和Siha细胞系中沉默Pin1并获得稳定细胞株:成功获得并鉴定Hela-shPin1/Hela-shNC和Siha-shPin1/Siha-shNC细胞系。（2）合成和鉴定新型Pin1抑制剂KPT-6566:合成并获得KPT-6566,通过质谱确认分子量为466,通过核磁共振氢谱确认化学结构,与目标化合物一致。（3）KPT-6566抑制Pin1及相关蛋白表达水平:Western blot结果显示,KPT-6566处理后Pin1、c-Jun、β-catenin、cyclinD1、AKT-p473、EKK1/2、p65/NF-κB和GSTP1蛋白表达减少,γ-H2AX表达水平增加。以上结果表明,成功获得沉默Pin1细胞株,成功合成KPT-6566,可以用于后续实验。3.Pin1作为宫颈癌治疗靶点的研究（1）抑制Pin1对细胞增殖的影响:Hela-shPin1和Siha-shPin1克隆形成能力显著低于对照组(P_Hela=0.005;P_Siha=0.013);KPT-6566处理后Hela和Siha克隆形成能力显著均低于对照组(P_Hela=0.017;P_Siha=0.009)。（2）抑制Pin1对细胞迁移和侵袭的影响:划痕实验结果显示,Hela-shPin1和Siha-shPin1细胞伤痕愈合距离低于对照组(P_Hela=0.002;P_Siha=0.015);Transwell实验结果显示,穿过小室细胞数显著少于对照组(P_Hela<0.001;P_Siha=0.002)。KPT-6566处理后Hela和Siha细胞伤痕愈合距离显著低于同组对照组(P_Hela=0.007;P_Siha=0.026);穿过小室细胞数显著少于对照组(P_Hela<0.001;P_Siha=0.001)。裸鼠肿瘤细胞肝转移模型结果显示,接种Siha-shPin1组肝组织中肿瘤细胞转移灶数量显著少于对照组（P=0.012）,肝坏死面积显著低于对照组（P=0.007）;使用KPT-6566治疗组小鼠肿瘤细胞肝脏转移灶数量显著少于对照组（P=0.013）,肝脏坏死面积显著低于对照组（P=0.006）（3）Pin1通过c-Jun/Slug对宫颈癌细胞EMT的影响:与对照组相比,Hela-shPin1与Siha-shPin1细胞c-Jun、Slug、N-cadherin和Vimentin低表达,E-cadherin高表达;与对照组相比,KPT-6566处理后c-Jun、Slug、N-cadherin和Vimentin低表达,E-cadherin高表达。Hela-shPin1和Siha-shPin1细胞过表达c-Jun后,Slug、N-cadherin和Vimentin高表达、E-cadherin低表达。以上结果表明,抑制Pin1显著降低宫颈癌细胞增殖能力与运动能力,Pin1可以作为宫颈癌治疗的潜在靶点。4.KPT-6566增强顺铂对宫颈癌细胞杀伤效果（1）KPT-6566显著增强顺铂对宫颈癌细胞的杀伤效果:透射电镜结果显示,低剂量顺铂联合KPT-6566导致细胞膜破裂,凋亡小体出现,细胞崩解。流式细胞术结果显示,KPT-6566显著增加顺铂介导细胞凋亡率;Western Blot结果显示,联合治疗组Hela和Siha细胞cleaved-caspase3和cleaved-PARP表达显著增加。以上结果表明,KPT-6566增强宫颈癌细胞对顺铂治疗的反应性。（2）KPT-6566增强裸鼠异种移植瘤模型中顺铂的抗肿瘤作用:裸鼠异种移植瘤实验结果显示,联合治疗组小鼠异种移植瘤体积和质量显著小于对照组,移植瘤内坏死面积大于对照组,凋亡细胞数多于对照组。H&E染色结果显示,联合治疗对小鼠心、肝、脾、肺和肾组织无损伤。以上结果表明,KPT-6566在体内有效增强顺铂对宫颈癌细胞的治疗反应性。具有作为宫颈癌新疗法的潜力。结论:1.Pin1可作为宫颈上皮内瘤变风险的评估指标。2.抑制Pin1明显降低宫颈癌细胞增殖及转移,Pin1可作为宫颈癌新型治疗靶点。3.KPT-6566显著增强宫颈癌细胞对顺铂治疗的反应性,具有潜在的临床应用价值。