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背景与目的鳞状细胞癌（Squamous cell carcinoma,SCC）是头颈部恶性肿瘤的主要组织学类型,占这些部位恶性肿瘤的90%-95%,头颈部鳞状细胞癌（Head and neck squamous cell carcinoma,HNSCC）是全球排名第六的常见恶性肿瘤,其中口腔鳞状细胞癌（Oral squamous cell carcinoma,OSCC）占 HNSCC的25%,且舌鳞状细胞癌（Tongue squamous cell carcinoma,TSCC）所占比例较高。TSCC是一种具有高度侵袭性的恶性肿瘤,容易发生局部复发和远处转移。此外,TSCC在发生发展过程中常无特异性症状从而给早期诊断制造了巨大困难,最终导致预后不良。即使采用放化疗及手术等联合治疗,其5年的生存率仍不理想。恶性肿瘤的发生发展是一个多因素的过程,其中环境因素、遗传易感性、不良生活方式（如酒精和烟草）和病毒感染（人类乳头瘤病毒）在内的诸多因素与TSCC的发生有关,但TSCC发生发展的详细分子机制尚不清楚。因此,现迫切需要进一步探索发现TSCC发生发展的相关分子机制,为临床早期诊断及治疗TSCC提供新的策略。转录激活因子3（Activating transcription factor 3,ATF3）为ATF/CREB（Activating transcription factor/cyclic amp response element-binding）家族成员之一,是调节细胞应激反应的关键转录因子,在不同的组织中表达水平和功能不同。近年来ATF3在肿瘤细胞中的作用得到了广泛关注,在不同的肿瘤类型和细胞环境中,ATF3既可作为癌基因又可作为抑癌基因并发挥相应功能。最近的研究发现ATF3是miR-488和miR-431的下游靶点,在TSCC的进展中发挥重要作用,但ATF3在TSCC细胞中的下游效应迄今尚未得到深入研究。本研究旨在探索ATF3在TSCC肿瘤细胞中的功能及其下游信号通路,为开发治疗TSCC等肿瘤的新疗法提供新的思路。材料与方法1.ATF3在TSCC组织及细胞中的表达本课题首先采用H＆E染色和免疫组织化学技术（Immunohistochemistry,IHC）检测了不同分化程度的TSCC组织以及正常舌组织中ATF3的表达。然后,通过细胞免疫荧光技术对TSCC细胞系CAL27和SCC-9以及正常口腔角质形成细胞（Human oral keratinocytes,HOK）进行ATF3染色分析,进一步明确ATF3在不同细胞系中的表达情况。最后,利用癌症基因组图谱（The cancer genome atlas,TCGA）数据库集中分析了HNSCC和TSCC中ATF3基因表达水平。2.ATF3对TSCC细胞增殖和迁移的影响为了研究ATF3对TSCC细胞功能的具体影响,本研究采用RNA指导的Cas9核酸酶基因编辑技术（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR/Cas9）敲除TSCC细胞系CAL27和SCC-25中的ATF3基因,并通过慢病毒感染过表达TSCC细胞系SCC-9和SCC-4中的ATF3基因。利用CCK-8技术检测ATF3基因敲除或过表达对TSCC细胞系增殖能力的影响;通过Transwell实验和细胞划痕实验检测敲除或过表达ATF3基因对TSCC细胞系迁移能力的影响。此外,通过Western blot技术检测了AKT和ERK信号通路在ATF3基因敲除或过表达时的激活情况。3.ATF3调控TSCC细胞增殖和迁移的分子机制为了探索ATF3基因调控TSCC细胞增殖和迁移的分子机制,本课题利用RNA-seq分析了敲除ATF3基因的CAL27细胞的mRNA基因表达谱。通过GO分析和基因测序获得敲除ATF3基因的CAL27细胞中相关信号通路和差异性表达的基因。通过qRT-PCR和ChIP分析确定在TSCC细胞中ATF3下游的两个靶点干扰素诱导蛋白6（Interferon-induced protein6,IFI6）和干扰素诱导蛋白27（Interferon-induced protein27,IFI27）。并通过IHC和TCGA数据库进一步确认IFI6和IFI27在TSCC组织中高表达。为了分析ATF3是否通过IFI6或IFI27调控TSCC细胞的增殖与迁移,本课题利用基因编辑技术敲低或过表达TSCC细胞中IFI6和IFI27基因,通过CCK-8、Transwell和细胞划痕等实验检测敲低或过表达IFI6和IFI27基因对TSCC细胞（己敲除或过表达ATF3基因）的增殖和迁移等功能的影响,并通过Western blot技术检测了 AKT和ERK信号通路的激活情况。为了进一步证明ATF3基因介导IFI6和IFI27的表达影响TSCC细胞的生物学行为,本课题利用nu/nu小鼠进行皮下荷瘤实验。将CAL27（ATF3+/+,对照组;ATF3-/-,实验组）细胞移植到nu/nu小鼠背侧皮下。通过形态学对比两组肿瘤生长情况;通过IHC和Ki-67染色进一步分析肿瘤的增殖分化情况。将过表达ATF3的SCC-9细胞进行IFI6和IFI27的过表达并移植到nu/nu小鼠背侧皮下,通过形态学对比肿瘤生长情况,通过IHC和Ki-67染色进一步分析肿瘤的增殖分化情况。结果1.ATF3在TSCC组织及细胞中低表达H＆E染色和IHC实验结果显示:ATF3在TSCC组织中低表达,并且在低分化TSCC组织中ATF3的表达降低最为显著。细胞免疫荧光染色结果显示,CAL27细胞和SCC-9细胞中ATF3的核染色明显低于HOK细胞,差异具有显著统计学意义。SCC-9细胞核中的ATF3表达水平低于CAL27细胞核中的ATF3蛋白表达水平,且差异具有统计学意义。TCGA数据库集中分析得出的结果与上述结果相同。2.ATF3负调控TSCC细胞的增殖与迁移利用敲除或过表达ATF3基因的TSCC细胞系,通过CCK-8、Transwell以及细胞划痕实验发现:ATF3基因敲除后,TSCC细胞的增殖能力以及迁移能力均显著提高;过表达ATF3基因后,TSCC细胞的增殖及迁移能力均显著降低。此外,Western blot结果发现敲除ATF3基因后,AKT和ERK信号通路激活,在ATF3基因过表达时其磷酸化水平受到抑制,提示ATF3可能通过抑制AKT和ERK通路的激活,负向调控TSCC细胞的增殖和迁移。3.ATF3通过下调IFI6和IFI27的表达抑制TSCC细胞增殖和迁移RNA-seq分析结果表明,敲除ATF3基因的CAL27细胞中差异性表达最明显的两个基因为IFI6和IFI27。通过qRT-PCR和ChIP分析进一步确定在TSCC细胞中ATF3下游的两个靶点为IFI6和IFI27。通过IHC和TCGA数据库再次确认IFI6和IFI27在TSCC组织中呈高表达。在体外实验中,本课题敲低或过表达TSCC细胞中IFI6和IFI27基因,发现在ATF3基因敲除的TSCC细胞中,IFI6或IFI27的敲低显著阻断了 ATF3缺失引起的CAL27细胞的增殖、迁移等能力的增强;在ATF3基因过表达的TSCC细胞中,IFI6或IFI27的过表达显著逆转了 ATF3过表达引起的SCC-9细胞的增殖、迁移能力的降低。同时,Western blot表明,ATF3缺失或过表达引起的AKT或ERK活性的相应变化被IFI6或IFI27表达所抵消。总的来说,这些数据表明ATF3通过下调IFI6和IFI27调控TSCC细胞的增殖和迁移能力。在体内实验中,通过对成瘤指标的检测发现:相比对照组,ATF3敲除组肿瘤显著增大。Ki-67免疫组化染色结果表明,敲除ATF3后TSCC细胞的增殖分化能力明显增强。相反,过表达ATF3组的肿瘤更小。但是,过表达IFI6和IFI27基因后TSCC细胞所形成的肿瘤明显增大。同样,通过Ki-67免疫组化染色表明过表达ATF3明显抑制肿瘤细胞的增殖,IFI6或IFI27的过表达阻断了这种抑制。免疫组化发现ATF3过表达诱导的TSCC细胞分化能力降低,而ATF3和IFI6或IFI27共同过表达的TSCC细胞分化能力显著提高。综上所述,ATF3在体内通过IFI6或IFI27的表达水平负向调节TSCC细胞的增殖。结论在本研究中,我们证实了 ATF3在TSCC中的低表达,并且胞核内ATF3的水平与TSCC低分化相关;此外,我们发现ATF3通过靶向IFI6和IFI27调节ERK和AKT信号通路,进而参与TSCC肿瘤的进展。我们的研究可能为ATF3作为标志物或靶点用于TSCC预后和治疗提供新的思路。