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一、研究背景溃疡性结肠炎（Ulcerative colitis,UC）是一类病因未明的慢性特发性肠道炎性疾病,既往在西方国家常见,近年来在我国发病率逐渐升高。UC在病程中不断反复,导致患者频繁住院、生活质量严重下降,而且由此造成的教育工作中断、病假以及沉重的医疗负担也对社会发展产生了巨大影响。UC的具体发病原因目前尚不清楚,但许多研究均提示肠道稳态的失衡以及肠黏膜屏障功能障碍是其发生发展的重要因素。作为固有免疫中含量丰富的免疫细胞,中性粒细胞是抵抗病原微生物入侵的第一道防线,而针对中性粒细胞和肠上皮屏障之间交互机制的探讨也逐渐成为该领域的研究热点。活化的中性粒细胞可以释放出解聚的染色质形成DNA网状支架,对病原体包围限制,这一结构被称为中性粒细胞胞外诱捕网（Neutrophil extracellular traps,NETs）,这一过程则称为中性粒细胞胞外陷阱相关死亡（Neutrophil extracellular traps-osis,NETosis）。在多种病原微生物入侵或者炎症刺激下,中性粒细胞通过染色质去致密化（去浓缩）释放出一种以DNA为骨架同时包裹着中性粒细胞弹性蛋白酶（Neutrophil elastase,NE）、髓过氧化物酶（Myeloperoxidase,MPO）、组蛋白尤其是瓜氨酸化的组蛋白H3（Citrullinated-H3,Cit H3）等多种蛋白质的过程。NETs可以帮助机体迅速捕获并杀灭入侵的细菌、真菌乃至病毒,是机体抵御微生物入侵的重要方式之一。虽然中性粒细胞发生NETosis的具体机制及功能调控尚不明确,目前普遍认为肽酰基精氨酸脱亚氨酶4（Peptidyl arginine deiminase,PAD4）介导的瓜氨酸化修饰是NETosis形成的关键环节。多项研究证实PAD4依赖的NETosis参与了关节炎、败血症、血栓栓塞等多种疾病的发生发展。在UC中,部分学者观察到患者肠道NETosis水平升高,但关于NETosis在UC的发生发展中具体作用机制目前尚不完全明确。本课题拟在现有研究的基础上,利用PAD4敲除小鼠,在组织学水平、细胞水平和瓜氨酸化修饰水平探讨PAD4介导的NETosis在UC发生发展中的作用,期望寻找一个新的靶点,为NETosis在UC的发病机制和诊疗思路提供一个新的方向。二、研究内容及方法（一）DSS小鼠和UC患者结肠组织NETosis水平的检测1、DSS构建C57/BL6小鼠结肠炎模型,DAI评分和结肠长度评估疾病活动程度;HE染色评估炎症程度;在基因表达水平（q PCR）和蛋白表达水平上（ELISA、Western blot或免疫荧光）检测结肠炎症因子水平、肠道屏障功能和NETosis指标PAD4、MPO、Cit H3、NE等。2、根据Mayo内镜评分,收集人体肠道组织活检样本和内镜图片（健康对照、轻中度UC、重度UC）,各组样本进行HE染色评估炎症程度,Western blot检测NETosis相关指标。3、UC患者的Mayo内镜评分和NETosis指标的相关性分析。（二）PAD4敲除小鼠肠炎组织NETosis水平和炎症屏障指标的检测1、构建PAD4敲除小鼠并进行基因型鉴定。2、构建DSS诱导的野生型和PAD4敲除小鼠的结肠炎模型,DAI评分和结肠长度评估疾病活动程度;HE染色评估结肠炎症程度;在基因表达水平（q PCR）和蛋白表达水平上（ELISA、Western blot或免疫荧光）检测结肠炎症因子水平、肠道屏障功能和NETosis指标PAD4、MPO、Cit H3、NE等。3、免疫组化和Western blot评估PAD4敲除小鼠结肠组织的瓜氨酸化水平。（三）PAD4敲除小鼠肠炎组织瓜氨酸测序及单细胞测序分析1、DSS诱导的野生型和PAD4敲除小鼠结肠组织蛋白质组学测序分析和瓜氨酸化测序分析,Western blot验证小鼠结肠组织中的瓜氨酸化差异蛋白。2、DSS诱导野生型和PAD4敲除小鼠结肠组织单细胞测序分析,细胞亚型分析和功能富集分析。3、结合单细胞测序与瓜氨酸化测序结果,评估Padi4和Ckmt1基因的高表达细胞类型,并在小鼠结肠组织进行免疫荧光共定位验证。（四）NETosis介导的瓜氨酸化对肠上皮细胞屏障和凋亡水平的探索1、离子霉素（Ionomycin）刺激小鼠外周血中性粒细胞后利用免疫荧光、Western blot、和细胞上清ELISA验证NETosis相关指标。2、293T细胞过表达CKMT1和点突变的CKMT1-R242K,经Ionomycin诱导野生型和PAD4敲除小鼠中性粒细胞上清处理后,Western blot和免疫沉淀分别检测CKMT1蛋白水平和瓜氨酸化的CKMT1水平。3、Ionomycin诱导野生型小鼠中性粒细胞后分别予蛋白酶抑制剂MG132和自噬抑制剂Chloroquine或3-MA处理后,细胞上清处理过表达CKMT1的293T细胞后检测细胞CKMT1的表达水平,探究CKMT1通过何种途径发生降解。4、Ionomycin刺激小鼠中性粒细胞后收集培养基上清提取细胞外囊泡（extracellular vesicles,EVs）进行透射电镜和纳米颗粒追踪颗粒分析检测,Western blot检测EVs中PAD4和EVs相关标记物（CD9、CD81、TSG101等）的表达水平;Ionomycin诱导野生型小鼠中性粒细胞同时添加EVs抑制剂GW4869,收集上清刺激NCM460细胞。Western检测细胞PAD4的表达水平,以探究PAD4是否可通过细胞外囊泡途径进入肠上皮细胞。5、Ionomycin诱导的野生型和PAD4敲除小鼠中性粒细胞上清刺激Caco-2和NCM460细胞,Western blot检测总蛋白瓜氨酸化水平、上皮屏障指标（E-cadherin、Occludin、Claudin1）和凋亡相关指标（Bcl2、cleaved-caspase3）。6、构建过表达CKMT1和CKMT1-R242K点突变的NCM460稳转株,经Ionomycin诱导的野生型和PAD4敲除小鼠中性粒细胞上清处理后,Western blot和免疫沉淀分别检测CKMT1蛋白水平和瓜氨酸化的CKMT1水平,Western blot检测上皮屏障指标（E-cadherin、Occludin、Claudin1）和凋亡相关指标（Bcl2、cleaved-caspase3）。三、研究结果（一）DSS小鼠和UC患者结肠组织NETosis水平显著升高1、DSS诱导的野生型小鼠肠道屏障受损、炎症指标升高、NETosis水平显著升高。2、DSS诱导的野生型小鼠结肠蛋白瓜氨酸化水平显著升高,与PAD4表达水平正相关。3、UC患者结肠组织NETosis水平升高,与内镜评分成正相关。（二）PAD4敲除结肠炎小鼠NETosis水平显著降低1、PAD4敲除小鼠结肠炎症较野生型显著减轻,促炎因子表达降低。2、PAD4敲除小鼠结肠上皮屏障损伤较野生型减轻,屏障相关分子表达升高。3、PAD4敲除小鼠结肠NETosis水平较野生型显著降低。（三）PAD4敲除结肠炎小鼠瓜氨酸化水平显著降低1、PAD4敲除后DSS小鼠结肠组织在蛋白质组学水平发生明显变化,差异上调的蛋白主要富集在与线粒体相关的能量代谢通路中。瓜氨酸化测序中筛选到12个差异蛋白发生了瓜氨酸化水平的变化,具有显著差异性的CKMT1-243位点瓜氨酸化水平在野生型结肠炎小鼠升高,在PAD4敲除的结肠炎小鼠显著下降。2、单细胞测序定义了Padi4high和Padi4low两个亚群的中性粒细胞,Padi4low亚群与氧化磷酸化、凋亡、溶酶体等通路相关;定义了8种上皮细胞亚型,其中未成熟的远端上皮细胞在PAD4敲除小鼠显著增多,主要与氧化磷酸化、三羧酸循环及肠道感染相关。3、单细胞测序提示Padi4基因在中性粒细胞高表达,在上皮细胞低表达;Ckmt1在上皮高表达,在中性粒细胞低表达。小鼠结肠免疫荧光染色证实了CKMT1蛋白与上皮标志物EPCAM共定位,与中性粒细胞标志物Ly6G无明显共定位。（四）NETosis介导CKMT1瓜氨酸化影响上皮细胞屏障和凋亡1、Ionomycin可诱导野生型小鼠外周血中性粒细胞发生NETosis,PAD4-/-小鼠中性粒细胞NETosis过程受到明显抑制。2、中性粒细胞诱导NETosis后主要通过242位点的瓜氨酸化促进CKMT1总体瓜氨酸化水平的升高,而CKMT1蛋白水平降低可能与自噬-溶酶体途径有关。3、PAD4-/-小鼠的中性粒上清可显著减轻Caco-2和NCM460细胞的瓜氨酸化水平、缓解屏障损伤和细胞凋亡。3、中性粒细胞诱导NETosis后,PAD4可经由细胞外囊泡途径进入肠上皮细胞,通过CKMT1-242位点（对应小鼠CKMT1-243位点）的瓜氨酸化从而影响肠上皮屏障和细胞凋亡。四、研究结论本课题首先在DSS小鼠和UC病人中观察到NETosis水平的升高,通过构建PAD4敲除小鼠,发现PAD4敲除后可显著缓解小鼠结肠炎和NETosis水平。瓜氨酸化测序分析发现CKMT1-243位点的瓜氨酸化水平在野生型结肠炎小鼠显著升高而在PAD4敲除小鼠显著降低,单细胞测序和免疫荧光共定位验证了CKMT1主要在肠上皮中高表达。细胞水平上,利用Ionomycin刺激小鼠外周血中性粒细胞诱导NETosis后,其上清可促进CKMT1瓜氨酸化水平的升高、上皮屏障的损伤以及凋亡水平的升高。CKMT1-242位点（对应小鼠243位点）突变后,CKMT1的瓜氨酸化水平明显降低,上皮屏障损伤和凋亡水平显著减轻。本课题揭示了中性粒细胞NETosis发生后,PAD4可能经由细胞外囊泡途径进入上皮细胞,通过介导CKMT1-242位点（对应小鼠243位点）的瓜氨酸化从而影响肠上皮屏障和凋亡,为NETosis在UC机制中的探索提供了新的方向。