研究背景:鼻咽癌（Nasopharyngeal carcinoma,NPC）是头颈部最常见的恶性肿瘤之一,是起源于鼻咽粘膜内层的上皮性癌,常发生在鼻咽部咽隐窝处,位置特殊不易发现。NPC具有恶性程度高、易转移及早期症状不易发现的特点。早期鼻咽癌患者单独接受放射治疗或与化疗联合使用可明显改善临床疗效,但是毒副作用大。然而,NPC通常发现即为晚期,此期间易局部复发、远处转移和耐药,故治疗方案少、临床疗效差。因此,研究活性高、毒副作用小的抗肿瘤药物是目前肿瘤研究的主要方向之一。近年来传统中药在抗癌方面的优势被越来越多的关注。人参皂苷及代谢物因具有调节免疫、抑制肿瘤增殖、诱导细胞凋亡、自噬及放疗协同作用等抗肿瘤活性,已被应用于部分晚期癌症患者的临床治疗,并取得了较好的治疗效果。20S-原人参三醇（20S-protopanaxatriol,20S-PPT,文中简称PPT）是人参次级代谢产物,由原人参三醇组人参皂苷Rg1水解掉C-20和C-6位葡萄糖,最终代谢产生的苷元。与Rg1相比,PPT具有更强的生物活性,具有抗肿瘤、抗炎、抗糖尿病及改善肝脏纤维化等作用。同时作为主要的抗肿瘤活性成分,PPT能明显抑制肿瘤细胞,增加肿瘤细胞对化疗药物的敏感性并克服其耐药,提高联合治疗的效果。尽管PPT在多种肿瘤中具有抗肿瘤效果,但是在鼻咽癌领域还未被研究,我们将在本研究中进一步探索。研究目的:本研究利用TMT标记蛋白质谱检测结合生物信息学分析和分子生物学实验技术,旨在探索PPT靶向S100A4/Wnt信号通路及线粒体功能来调控NPC细胞增殖、迁移及凋亡的作用,并探讨其体内、外作用机制。本文的主要研究内容和结论如下:1.PPT体外对鼻咽癌细胞的增殖、转移及凋亡的影响利用无水乙醇溶解PPT并配置不同浓度,作用人鼻咽癌细胞5-8F及6-10B 24 h。通过CCK8法测定细胞活力,结果发现5-8F及6-10B细胞经PPT处理后存活率随浓度增高而显著降低。通过克隆形成检测5-8F及6-10B细胞增殖能力,结果表明PPT以剂量依赖性明显抑制细胞克隆的形成。通过流式细胞术分析不同浓度PPT处理的5-8F及6-10B细胞周期分布情况,结果显示随着PPT浓度增加,G0/G1期细胞明显增加,而S期或者G2期细胞减少。细胞周期结果表明,PPT导致5-8F及6-10B细胞周期阻滞在G0/G1期。通过划痕和Transwell迁移实验检测5-8F及6-10B细胞迁移能力,发现PPT以剂量依赖性抑制肿瘤细胞迁移。此外,利用流式细胞术进一步考察PPT对细胞凋亡的影响。结果发现,与对照组相比,采用不同浓度PPT作用5-8F及6-10B细胞的总凋亡率、早期或晚期凋亡的细胞比例均随PPT浓度增加而升高,特别是晚期凋亡率。TUNEL结果显示,随着PPT浓度增加,TUNEL阳性信号细胞数量逐渐增多。Western blot结果显示,随着PPT浓度增加,凋亡蛋白Bax、Caspase-3和Caspase9表达明显增加,抗凋亡蛋白Bcl-2表达显著下降。结果表明:PPT不仅可明显抑制鼻咽癌细胞的活力、增殖及迁移能力,并且可促发细胞周期阻滞和诱导鼻咽癌细胞的凋亡。2.基于蛋白质组学检测对PPT抗鼻咽癌作用机制的探索前期通过增殖、迁移及凋亡实验发现,PPT（80 μM）处理5-8F及6-10B细胞24 h可以明显促进细胞凋亡、抑制增殖及迁移。对3例80 μM处理的6-10B细胞和3例未处理的6-10B细胞进行TMT标记液相色谱串联质谱法（LC-MS/MS）蛋白质谱检测。结果共检测到6174个蛋白,其中显著差异蛋白共374个,包含46个差异上调蛋白和328个差异下调蛋白。在GO和KEGG数据库中Wnt信号通路均被显著富集到,因此PPT抑制鼻咽癌细胞可能和Wnt信号通路相关,我们通过分析显著差异蛋白中与Wnt通路密切相关的蛋白,同时利用分子对接技术,认为S100A4可能是PPT抗鼻咽癌的重要靶蛋白之一。为了探索PPT与蛋白之间的作用力,根据在蛋白数据库中具有可查询的蛋白质受体的晶体结构,本部分进行了分子模拟对接,结果发现其中PPT与S100A4（PDB ID:2MRD）的对接结合能很高,可达-30.138 KJ/mol。PPT对S100A4有很高的亲和力,并与S100A4活性部位的相邻氨基酸显示出关键的分子对接作用,进一步表明PPT可能通过S100A4/Wnt信号通路发挥抗肿瘤作用。为了进一步研究PPT影响S100A4的表达水平,是否还影响其详细分布,我们进行了 dSTORM高分辨成像,定量分析定位的数量及簇的大小与蛋白质的表达量成正比,80μM PPT处理6-10B细胞后,S100A4表达明显减少。结果表明,PPT调节了 S100A4簇在细胞中的分布,下调了 S100A4的表达。同时差异蛋白在GO和KEGG数据库中线粒体功能亦均被显著富集到,结果说明PPT抗鼻咽癌作用亦跟线粒体功能相关。PPT显示的多靶点作用,是天然药物的一大特征。3.PPT体外抗鼻咽癌机制的研究和探索基于上部分对信号通路的筛选,接下来在体外进行验证。qRT-PCR检测分析显示,与对照组相比,转染siS100A4的5-8F及6-10B细胞中S100A4及β-catenin的mRNA表达水平均被下调。该结果与dSTORM成像数据一致。Western blot检测PPT作用或转染siS100A4后5-8F及6-10B细胞的S100A4/Wnt信号通路相关蛋白的表达。结果显示,在PPT作用和转染siS100A4的5-8F及6-10B细胞中,S100A4、β-catenin、Cyclin D1、Survivin及 C-Myc 的表达均被下调,两者结果一致;过表达S100A4后,β-catenin蛋白表达亦随S100A4蛋白表达的升高而增加。同时抑制S100A4后经CCK8、克隆形成、划痕及Transwell迁移实验检测两种细胞的细胞活力、增殖及迁移能力,结果显示:与对照组相比,转染了 siS100A4后的两种细胞的活力、增殖及迁移能力均明显降低。结果表明,PPT可通过下调S100A4/Wnt信号通路抑制两种鼻咽癌细胞的活力、增殖及迁移。然而,5-8F及6-10B细胞经PPT处理后出现明显凋亡,而抑制S100A4/Wnt信号通路后却观察不到。这可能由于PPT通过其他靶点引发细胞凋亡。根据前期我们检测的线粒体凋亡相关蛋白结果显示,PPT通过启动线粒体凋亡途径诱导5-8F及6-10B细胞凋亡。生物电子显微镜观察线粒体发现,与对照组、siNC组和siS100A组相比,PPT处理组的5-8F及6-10B细胞内线粒体数量减少,形态肿胀,嵴突断裂、紊乱甚至消失,线粒体外膜局部破裂。活性氧（Reactive oxygenpecies,ROS）检测结果显示,随着PPT浓度的增加,细胞中的ROS水平明显升高,ROS聚集可损伤线粒体。线粒体膜电位检测结果显示,经中、高浓度PPT作用后细胞的线粒体膜电位（Mitochondrial membrane potential,MMP）明显去极化,这是细胞凋亡早期的标志性变化。细胞的能量大部分是线粒体通过氧化磷酸化呼吸作用产生ATP供给,通过耗氧率（Oxygen consumption rate,OCR）检测线粒体的呼吸功能和ATP的产量,结果显示,与对照组相比,PPT组的基础呼吸、最大呼吸及ATP产生都明显下降,表明PPT作用细胞后损伤线粒体的呼吸功能,从而导致ATP的产生下降。由于细胞能量供给除了线粒体的氧化磷酸化,其余由糖酵解来提供,最后我们通过细胞外酸化率（Extracellular Acidification Rate,ECAR）来检测细胞的糖酵解能力,结果显示,与对照组比较,经PPT作用的5-8F和6-10B细胞的糖酵解能力显著下降,而转染了 siRNA的细胞并未出现类似的结果。这些结果表明,PPT通过引起线粒体损伤导致功能障碍、破坏氧化磷酸化及降低糖酵解能力,导致ATP生成减少,破坏鼻咽癌细胞的能量代谢平衡及启动线粒体凋亡途径促进细胞凋亡。4.PPT体内抗鼻咽癌作用及机制的研究建立裸鼠鼻咽癌移植瘤模型,设置对照组、PPT低剂量组、PPT高剂量组和阳性对照组（顺铂组）,治疗过程中监测小鼠体重和瘤径并绘制小鼠生长曲线及肿瘤生长曲线。结果发现,与对照组相比,PPT高剂量治疗组和顺铂组的小鼠肿瘤生长缓慢,只有顺铂组的小鼠体重有所下降。与对照组比较,PPT高剂量组和顺铂组小鼠移植瘤的重量明显下降。血常规和肝肾功能结果显示,不同剂量PPT治疗组小鼠的各项指标均在正常范围之内,对小鼠脏器HE染色后均未发现明显的病理改变。HE染色结果显示PPT高剂量组瘤内细胞较对照组稀疏,并且局部可见少量坏死。免疫组化染色显示PPT高剂量组小鼠瘤体内增殖相关蛋白Ki67降低,凋亡蛋白Caspase 3及Bax的表达相应增加,抗凋亡蛋白Bcl-2的表达则升高。TUNEL染色显示PPT高剂量组肿瘤细胞凋亡明显增强。以上结果表明PPT在体内能抑制肿瘤细胞增殖并促进凋亡,同时具有良好的安全性。最后通过免疫组化（Immunohistochemistry,IHC）、免疫荧光（Immunofluorescence,IF）及 Western blot检测肿瘤组织中S100A4及β-catenin的表达,结果显示PPT高剂量治疗组中S100A4及β-catenin的表达均明显下降。以上结果表明在体内,PPT同样通过启动线粒体相关凋亡及下调S100A4/Wnt信号通路发挥抗肿瘤作用,进一步验证了体外细胞实验结果。结论:1.体外实验发现PPT不仅可明显抑制鼻咽癌细胞的活力、增殖及迁移能力,并且可促发细胞周期阻滞和诱导鼻咽癌细胞的凋亡。2.通过蛋白质谱的检测、生物信息学分析、分子对接技术及dSTORM高分辨率成像技术,初步锁定S100A4/Wnt信号通路及线粒体功能可能是PPT抗鼻咽癌作用的重要通路及靶点之一。PPT显示的多靶点作用,是天然药物的一大特征。3.体外实验验证PPT通过靶向S100A4/Wnt信号通路抑制鼻咽癌细胞的增殖与迁移,通过损伤线粒体、启动线粒体凋亡途径和抑制糖酵解功能诱导鼻咽癌细胞凋亡。4.PPT在鼻咽癌移植瘤小鼠体内治疗中具有良好的有效性和安全性。PPT不仅能抑制移植瘤生长,还能促进肿瘤细胞凋亡;同时表明PPT通过启动线粒体凋亡途径及下调S100A4/Wnt信号通路的表达实现抗鼻咽癌作用,再次论证了体外实验的结果。