酸性蛋白酶是一种能在酸性环境下水解蛋白质的酶类,其最适作用pH值为2.5~5.0。由于酸性蛋白酶具有较好的耐酸性,因此被广泛地应用于食品、医药、轻工、皮革工艺以及饲料加工工业中。宇佐美曲霉是工业化生产酸性蛋白酶的主要菌种,但是酸性蛋白酶的表达受碳源和氮源阻遏的调控和蛋白质的诱导,并受严格的pH控制,导致其发酵条件不易控制,发酵酶活不稳定。利用宇佐美曲霉工业化生产酸性蛋白酶的酶活还有待进一步提高。真核生物表达系统是高效表达蛋白的有效手段。酵母作为表达外源蛋白的工程菌日益受到重视。它具有基因表达调控和蛋白修饰功能,克服了原核表达系统中产物活性低以及包涵体的变性、复性等的问题。而且,酵母可以通过高密度发酵,且分泌产物与天然蛋白相似,临床应用较安全。同样黑曲霉卓越的表达和分泌能力也一直是吸引人们的最大特点。并具有真核分泌机制,很可能还具有与哺乳动物系统相似的蛋白修饰性能,如高甘露糖型和N-糖基化等,也是表达真核基因的理想系统。通过基因工程手段在酵母和黑曲霉中高效表达酸性蛋白酶,对于简化发酵条件、提高酶制剂产量都具有重要意义。本研究以酸性蛋白酶基因生产菌种宇佐美曲霉为基因供体,克隆酸性蛋白酶基因(pepA),构建其毕赤酵母表达载体,并通过电击法转化毕赤酵母,以获得高效表达酸性蛋白酶的工程菌。同时,试图通过农杆菌介导法敲除糖化酶生产菌黑曲霉的pyrA基因和ku70基因,获得黑曲霉受体菌,并构建农杆菌介导的pepA基因同源重组载体,为黑曲霉表达系统的建立和实现pepA基因在黑曲霉中的高效表达奠定基础。主要研究成果如下:1.基因的克隆采用RT-PCR方法克隆得到了宇佐美曲霉pepA基因的cDNA序列,采用PCR方法克隆得到了黑曲霉pyrA基因,黑曲霉ku70基因5′和3′同源臂基因,黑曲霉glaA基因启动子和终止子,瑞氏木霉pyrG基因,以及宇佐美曲霉pepA基因。测序结果正确。2.酸性蛋白酶基因在毕赤酵母中的表达构建了pepA基因的毕赤酵母表达载体pGAPHαm-pepAc。将载体线性化并通过电击转化毕赤酵母。经转化子PCR鉴定得到重组子GS115-pGAPHαm-pepAc。在最适发酵条件下,GS115-pGAPHαm-pepAc分泌表达的酸性蛋白酶最高酶活为1289.68u/mL。3.黑曲霉表达载体构建构建了pyrA、ku70、glaA、pepA基因的相关载体pEMT-pyrA,pEMT-△pyrA,pEMT-△kusA,pEMT-△kusA-pyrG,pEMT-△glaA-pepA,并将这些载体通过冻融法转入到根癌农杆菌GV3101中,以用于下一步转化黑曲霉。4.黑曲霉pyrA基因缺失突变菌株的构建以黑曲霉UV48为受体材料,利用农杆菌介导法将表达载体pEMT-△pyrA对黑曲霉进行遗传转化。筛选培养基中加入5-氟乳清酸,获得了一些抗性菌株,但经过PCR鉴定后,发现这些抗性菌株并非pyrA基因缺失突变菌株。此实验在进一步进行中。