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β-1,3-1,4-葡聚糖酶（EC 3.2.1.73）是一种重要的β-葡聚糖水解酶,能特异性水解β-葡聚糖中β-1,3-糖苷键和β-1,4-糖苷键,是工业应用如啤酒酿造、饲料行业中重要的酶制剂。在工业应用中,β-1,3-1,4-葡聚糖酶需要在高温环境下使用,因此良好的热稳定性是β-1,3-1,4-葡聚糖酶的必不可少的特性。但目前大多数β-1,3-1,4-葡聚糖酶存在酶活性较差、热稳定性较低等问题。针对上述问题,本文克隆了来源于产琥珀酸丝状杆菌（Fibrobacter succinogenes）的β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因（Fsglu）和来源于泡盛曲霉（Aspergillus awamori）的β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因（Aaglu）,将其在毕赤酵母（Pichia pastoris）X33中表达,成功构建了P.pastoris X33/Fsglu和P.pastoris X33/Aaglu重组菌株。并将两种重组菌分别进行摇瓶培养和发酵罐培养,以探究其表达水平。对酶活性更好的Aaglu进行定点突变,获得了耐热性增强的突变体V152R、A106P和T110P。并进一步构建高拷贝P.pastoris X33/Aaglu-N5菌株,实现了β-1,3-1,4-葡聚糖酶的高效表达。论文的主要结果如下:（1）Fsglu和Aaglu基因在P.pastoris X33中异源表达。构建了P.pastoris X33/Fsglu和P.pastoris X33/Aaglu重组菌,经摇瓶发酵后分析表明,P.pastoris X33/Fsglu酶活为996.1 U·m L-1,P.pastoris X33/Aaglu酶活为1637.2 U·m L-1,P.pastoris X33/Aaglu酶活是P.pastoris X33/Fsglu的1.6倍。进一步将重组菌株P.pastoris X33/Fsglu和P.pastoris X33/Aaglu进行3 L发酵罐放大培养,经过96 h左右的诱导发酵后P.pastoris X33/Aaglu的酶活为9663.1 U·m L-1,经过96 h诱导发酵后时P.pastoris X33/Fsglu酶活达到5631.2U·m L-1,重组菌株P.pastoris X33/Fsglu和P.pastoris X33/Aaglu罐上酶活分别是摇瓶水平的5.1倍和5.4倍。（2）构建Aaglu突变体并研究其酶学性质。利用生物信息学软件Po PMu Si C和Fold X计算潜在的热稳定性突变位点,构建了6个单点突变体,用P.pastoris X33进行异源分泌表达。通过测定突变体和野生酶的热稳定性,酶学性质,酶促反应动力学,分析了突变体和野生酶的差异,最终筛选出热稳定性提高较为显著的3个突变体V152R、A106P和T110P。酶学性质表明,3个突变体和野生酶最适反应温度为50°C,最适反应p H为5.0,在酸性环境（p H 2.0-6.0）具有良好的稳定性。热稳定性实验表明,在60-90°C保温20 min后,3个突变体相对酶活力较野生酶均有显著提高。其中,经过90°C高温保温20 min后突变体V152R、A106P和T110P的相对酶活力分别是野生酶的3.6、3.0和1.6倍。除此之外,通过酶促反应动力学分析发现,与野生酶相比,三种突变体V152R、A106P和T110P的KM值分别较野生酶降低了73.5%、64.9%和37.5%,kcat/KM值分别是野生酶的4.5、3.4和2.3倍。说明三个突变体对底物亲和力和催化效率均有所提高。分析表明,突变体中形成了新的氢键、疏水作用和loop区域插入脯氨酸,对提高酶的热稳定性发挥了重要作用。本研究通过定点突变改造Aaglu的热稳定性,获得了催化效率提高、热稳定性增强的突变体,为β-1,3-1,4-葡聚糖酶在食品和饲料工业广泛应用奠定了良好基础。（3）Aaglu的高效表达。构建了P.pastoris X33/Aaglu-N3和P.pastoris X33/Aaglu-N5高表达菌株。测得P.pastoris X33/Aaglu-N3摇瓶酶活为1982.1 U·m L-1,是P.pastoris X33/Aaglu单拷贝的1.2倍。P.pastoris X33/Aaglu-N5摇瓶酶活为3283.2 U·m L-1,是P.pastoris X33/Aaglu单拷贝的2.0倍,P.pastoris X33/Aaglu-N5经过3 L发酵罐诱导120 h酶活为35021.1 U·m L-1,与单拷贝相比,酶活提高了3.9倍,以此方法显著提高了Aaglu的表达水平。