【摘 要】
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研究背景:卵巢癌是常见的女性恶性肿瘤,死亡率高居妇科肿瘤之首。目前,对于卵巢癌的病因、发病机理及复发转移等认识不足,卵巢癌的早期诊断和治疗仍面临很大挑战,现有卵巢癌筛查手段的敏感性和特异性仍不尽人意。随着生物技术、检测仪器及方法的不断发展,各种有潜力的生物标志物和治疗靶标已经初步显示广阔的运用前景,并引起广泛关注。着丝粒蛋白O（Centromere protein O,CENP-O）是新近发现的一
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研究背景:卵巢癌是常见的女性恶性肿瘤,死亡率高居妇科肿瘤之首。目前,对于卵巢癌的病因、发病机理及复发转移等认识不足,卵巢癌的早期诊断和治疗仍面临很大挑战,现有卵巢癌筛查手段的敏感性和特异性仍不尽人意。随着生物技术、检测仪器及方法的不断发展,各种有潜力的生物标志物和治疗靶标已经初步显示广阔的运用前景,并引起广泛关注。着丝粒蛋白O（Centromere protein O,CENP-O）是新近发现的一种与细胞死亡相关的结构性着丝粒蛋白,是有丝分裂过程中双极纺锤体组装、染色体分离和检查点信号传递所必需的[1]。据报道,CENP-O在多种肿瘤(如膀胱癌[2,3]、胃癌[4]等)中被检测到有异常高表达,并参与调控肿瘤细胞的增殖等过程,但在卵巢癌中是否存在CENP-O的高表达以及CENP-O在卵巢癌发生发展中可能的作用尚未见相关研究报道。本研究通过设计构建含CENP-O RNA干扰序列的慢病毒载体感染卵巢癌细胞系SKOV3后,敲减CENP-O基因的表达、检测细胞增殖、凋亡等生物学功能变化及CENP-O在卵巢癌细胞增殖、凋亡中的作用,探讨CENP-O作为上皮性卵巢癌诊疗靶点的可能性及价值。实验目的:检测不同卵巢癌细胞系中CENP-O基因的表达情况,并构建CENP-O基因敲减的稳定转染卵巢癌细胞系,研究CENP-O对于卵巢癌细胞增殖、凋亡能力的影响。实验方法:1、Real-time quantitative PCR（qPCR）检测CENP-O基因在不同卵巢癌细胞（SKOV3、OVCAR-3、ES-2）中mRNA的表达丰度,选取表达丰度最高的细胞系（CENP-O强阳性细胞系）作为实验细胞。2、设计构建含CENP-O RNA干扰序列的慢病毒载体,感染CENP-O强阳性细胞系;构建并鉴定CENP-O基因敲减的稳定转染细胞系。通过qPCR检测CENP-O基因的敲减率。3、Caspase3/7检测验证敲减CENP-O基因对细胞凋亡的影响;克隆形成实验及MTT检测验证敲减CENP-O对细胞增殖的影响;Western Blot方法检测细胞中CENP-O基因敲减后蛋白表达量的变化。实验结果:1、从qPCR结果得出,CENP-O基因在SKOV3、OVCAR-3、ES-2中存在高表达,其中SKOV3表达程度最高。2、经shRNA慢病毒感染SKOV3细胞后,CENP-O基因的表达量受到抑制（p<0.01）,敲减效率达到79.8%。3、Caspase3/7检测结果表明:敲减CENP-O基因使SKOV3细胞凋亡增多（p<0.01）;克隆形成实验结果表明:敲减CENP-O基因使SKOV3细胞克隆数减少（p<0.01）;MTT检测结果表明:SKOV3细胞敲减CENP-O基因后增殖减缓;Western Blot检测结果表明:在SKOV3细胞中,靶点对CENPO基因的内源敲减在蛋白质水平有显著的敲减作用。实验结论:1、CENP-O基因在3种卵巢癌细胞系（SKOV3、OVCAR-3、ES-2）中均存在显著表达。2、CENP-O基因敲减后,卵巢癌细胞的增殖克隆能力降低。3、CENP-O基因敲减后,卵巢癌细胞的凋亡增加。4、CENP-O基因敲减后,卵巢癌细胞中CENP-O基因的蛋白表达量减少。5、CENP-O具有分子治疗的靶标潜能,下调CENP-O基因的表达可打破癌细胞无限增殖能力,促使其凋亡,为后续进行分子机制研究及靶向治疗提供了基础和新思路。
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