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睾丸内曲精细管是精子发生的重要场所,曲精细管组织主要由支持细胞和各级生精细胞组成,支持细胞为生精细胞提供营养物质并对精母细胞最终发育成完整形态的精子具有至关重要的作用。精子发生是一个冗长、复杂的过程,其参与了遗传信息的传递,哺乳动物精子发生主要由三部分组成：精母细胞发生、减数分裂及精子形成,这一增殖分化过程由各种各样的分泌因子所调控并受制于生精细胞和支持细胞间大量基因和蛋白的相互调节作用。曲精细管中的多种蛋白质在精子发生过程中发挥了重要作用,但究竟有哪些蛋白参与及其具体分子调节机制目前尚未清楚。水牛是广西重要的经济物种,具有耐粗饲、饲料转化率高、乳品营养价值高等特点,但是其繁殖率低且整体研究水平不高,开展深入的基础研究将有助于实现其更大的经济价值。本研究将首次利用差异蛋白质组学的方法来比较不同时期(性成熟前期、性成熟期、性成熟后期)水牛睾丸曲精细管蛋白表达的差异,探索生精细胞和支持细胞在这三个不同发育时期蛋白质组成、含量等方面的变化,找出与水牛精子发生过程及其雄性生殖生理相关的标志性蛋白。主要采用双向电泳技术和液相色谱分离两大主流技术对不同时期水牛睾丸曲精细管差异蛋白进行研究,根据研究方法的不同,主要分为以下两章：第一章,采用双向电泳技术分析不同时期水牛睾丸曲精细管差异蛋白质组。主要包括两个部分,首先是水牛睾丸曲精细管双向电泳体系的建立和优化。通过对不同IPG胶条(线性与非线性)及胶条pH值、蛋白质上样量这三个参数进行比较和优化,建立适合于水牛睾丸曲精细管蛋白质分离的双向电泳体系。结果显示,采用上样量350μg的曲精细管总蛋白、24 cm且pH 4-7的线性IPG胶条能够更好的分离水牛睾丸曲精细管蛋白质,获得质量较好且分辨率较高的双向电泳图谱,通过对图像的分析检测,可得到大约486个蛋白点。其次,采用已优化并建立的双向电泳体系对不同时期(性成熟前期、性成熟期、性成熟后期)水牛睾丸曲精细管蛋白质进行分离,获取差异蛋白质并进行质谱鉴定。结果显示,以性成熟期水牛睾丸曲精细管蛋白表达图谱作为对照,筛选出性成熟前期与性成熟期水牛睾丸曲精细管差异蛋白150个,性成熟期与性成熟后期水牛睾丸曲精细管差异蛋白92个。质谱成功鉴定出性成熟前期与性成熟期水牛睾丸曲精细管差异蛋白点4个,对应4种蛋白质,在性成熟前期水牛睾丸曲精细管中均表现为下调；鉴定出性成熟期与性成熟后期水牛睾丸曲精细管差异蛋白点15个并对应13种蛋白质,在性成熟后期水牛睾丸曲精细管中表达上调的有8个,下调4个,只在性成熟后期水牛睾丸曲精细管中表达的有1个。本章试验建立了良好的水牛睾丸曲精细管双向电泳体系,分析并鉴定了一批水牛睾丸曲精细管差异蛋白质,并找出可能与水牛精子发生相关的差异蛋白质,如超氧化物歧化酶、热休克蛋白HSPA2、波形蛋白、抗增殖蛋白、细胞角蛋白KRT8及半乳凝集素1等。第二章,利用TMT定量标记结合二维液相色谱／质谱(2DLC-MS/MS)技术分析不同时期水牛睾丸曲精细管差异蛋白质组。主要包括三个部分,首先对不同时期(性成熟前期、性成熟期、性成熟后期)水牛睾丸曲精细管蛋白质酶解肽段进行TMT标记、液相分离和质谱鉴定。结果显示,四次重复标记试验共获得1290个重复蛋白质,差异倍数≥2.0的重复差异蛋白304个,以性成熟期水牛睾丸曲精细管作为对照,其中只在性成熟前期水牛睾丸曲精细管中表达上调的蛋白有252个,下调16个；只在性成熟后期水牛睾丸曲精细管中表达上调的蛋白有1个,下调26个；在性成熟前期和性成熟后期均表达下调的蛋白有9个。其次,对三个时期水牛睾丸曲精细管差异蛋白质进行生物信息学分析。主要进行GO分析及信号通路分析,同时结合UniProU SpermatogenesisOnline 1.0等数据库进行综合检索,发现27个与精子发生相关及26个与细胞生长发育、老化增殖相关的差异蛋白质。最后,从这些重要差异蛋白质中选取7个进行一系列验证。对这7个蛋白(CABS1、HSPA2、EEF1G、AKAP3、ROPN1、 ODF2、SPERT)进行Western blot和实时荧光定量PCR验证以及进一步的细胞定位分析。发现Western blot结果与TMT定量结果一致；HSPA2、EEF1G、AKAP3和SPERT在不同发育时期水牛睾丸曲精细管中的蛋白表达模式与mRNA表达模式一致；免疫组化分析结果发现,EEF1G主要定位于圆形精子细胞核上,同时在支持细胞和间质细胞核中有少量表达,HSPA2在细胞质、精原细胞及曲精细管基膜上有表达,CABS1主要在精子细胞胞质中表达；对其余的四个蛋白进行精子的免疫荧光分析发现,SPERT位于精子顶体、颈部和中段起始部分,AKAP3和ODF2主要位于精子顶体部分,ROPN1主要位于精子尾部主段。本章试验采用TMT结合2D LC-MS/MS技术能够对不同时期水牛睾丸曲精细管蛋白质进行有效地分离和鉴定,更加全面地展示水牛睾丸曲精细管在不同发育时期蛋白质的表达情况和变化规律。综上所述,本研究分别采用双向电泳和液相色谱技术对不同时期(性成熟前期、性成熟期、性成熟后期)水牛睾丸曲精细管蛋白质进行分离和质谱鉴定,首次建立了三个不同发育时期水牛睾丸曲精细管差异蛋白质表达谱。该研究结果将有助于阐明精子发生的分子机制,并找到可能与水牛精子发生相关的标志性蛋白,为后续水牛生殖调控的研究打下坚实基础。