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犬新孢子虫(Neospora canium)为顶复亚门原虫,主要引起牛的流产和犬的神经系统机能障碍。与弓形虫、疟原虫等其它顶复亚门原虫相比,关于新孢子虫蛋白功能和致病机制的研究报道较少。本研究拟开展新孢子虫棒状体蛋白(ROP)的研究,希望解析几种ROP的功能和作用机制。顶复亚门原虫的ROP种类很多,多种ROP在虫体生命活动中具有重要功能,弓形虫和疟原虫的有些ROP已经被确定为重要的毒力因子。目前对于新孢子虫的ROP研究报道较少,本课题组前期研究发现新孢子虫ROP18是假基因,分析发现ROP5和ROP16能在虫体内正常表达,作者拟对新孢子虫的ROP5和ROP16进行系统研究。生物信息学分析发现新孢子虫ROP5在基因组中存在三个重复拷贝,预测其有1个蛋白激酶结构域。利用同源重组技术构建新孢子虫ROP5基因缺失虫株(△ROP5),及其基因回补虫株(△ROP5-cm)。对ROP5各基因调控虫株与母源虫株比较研究显示,AROP5的入侵和噬斑形成能力减弱,增殖速度减慢。BALB/c小鼠腹腔接种1×106△ROP5虫株小鼠的脑荷虫量降低,3×106AROP5对小鼠的致病力下降,ROP5是影响新孢子虫致病力的重要因子。进一步的比较研究发现,AROP5的GRA7转录下调,ROP17转录上调,且△ROP5虫株的GRA7不能定位于纳虫空泡膜,ROP17弥散分布于虫体胞质。各基因调控虫株能刺激机体产生IFN-γ继而诱导细胞免疫因子GBP1、GBP2、IRGb6和IRGd的表达,但是AROP5接种后引起GBP1、GBP2和IRGb6表达量比其它虫株接种的细胞低。与母源虫株相比,AROP5接种巨噬细胞Raw246.7后GBP1和GBP2向纳虫空泡膜上的聚集能力增强约40%,说明虫体更容易被免疫细胞杀伤,初步证明ROP5通过调节GBP1和GBP2等细胞自主免疫途径介导新孢子虫的免疫逃避。本课题组前期研究发现新孢子虫能磷酸化宿主细胞STAT3,但发生机制尚不可知。我们分析发现ROP16含有保守的核定位信号和磷酸激酶结构域,KEGG通路分析发现ROP16的下游分子为STAT3。为了明确ROP16与虫体磷酸化宿主细胞STAT3之间的关系,我们构建了 ROP16基因缺失虫株(AROP16)、回补虫株(△ROP16-cm)和过表达虫株(ROP16-oe)。对各基因调控虫株进行比较研究,与母源虫株相比,AROP16的噬斑形成能力和增殖能力减弱,△ROP16-cm和ROP16-oe增强。将各虫株接种BALB/c小鼠30d后,发现△ROP16接种组小鼠脑荷虫量降低,AROP16-cm和ROP16-oe组小鼠脑荷虫量显著增加;AROP16接种组小鼠死亡率降低,ROP16-oe组小鼠死亡率升高。表明ROP16是新孢子虫发挥致病作用的重要因子。我们还发现与表达ROP16的虫株相比,△ROP16感染宿主细胞24 h后STAT3的磷酸化水平减弱;pcDNA3.1-NcROP16转染HEK293T细胞后能磷酸化细胞STAT3,进一步说明ROP16促进新孢子虫对宿主细胞STAT3的激活。我们对ROP16核定位信号和磷酸激酶结构域突变体的研究显示,mutROP16NLS不能进入宿主细胞核,mutROP16PKc不能磷酸化细胞STAT3,说明核定位信号是ROP16进入宿主细胞细胞核的关键结构,磷酸激酶结构域是在其发挥磷酸化功能的过程中起决定作用;对ROP16各基因调控虫株诱导巨噬细胞ANA1的凋亡进行检测发现,△ROP16感染组的细胞凋亡率显著降低,说明新孢子虫ROP16促进了宿主细胞的凋亡。