论文部分内容阅读
研究目的子痫前期（peeclampsia,PE）是胎盘源性、妊娠期特有疾病,严重危害母儿健康。研究表明,胎盘因素在PE发病机制中占重要地位,妊娠早期滋养细胞侵袭不足引起母体子宫螺旋动脉重塑障碍,胎盘灌注不足、缺血缺氧,触发氧化应激反应,多种胎盘因子释放后进入母体血液循环引起器官受损及相关临床症状,最终促进子痫前期的发生发展。有研究证明,对于子痫前期高危人群,自妊娠早期开始给予小剂量阿司匹林（lowdose aspirin,LDA）口服至妊娠36周,可减少子痫前期发病率及明显改善妊娠不良结局,但分子机制不明。氧化应激产物ROS可通过诱导NLRP3炎症小体活化参与细胞焦亡。本课题组前期实验证明,子痫前期患者体内存在细胞焦亡现象。因此,本研究分析胎盘组织中滋养细胞焦亡与子痫前期发病机制的相关性;在体外构建氧化应激反应诱导的PE发病过程中的滋养细胞焦亡模型;从细胞焦亡入手,为研究小剂量阿司匹林预防PE发生发展的作用机制奠定了基础。本项目的完成为研究子痫前期的发病机制、预防及治疗新药的研发提供了新思路。材料与方法1.采集临床资料及实验标本,检测胎盘中细胞焦亡通路的激活搜集单胎单病种PE病人胎盘标本25例,早发型子痫前期组胎盘标本（early onset severe preeclampsia,EOSP,17例,孕周<34周）,年龄（32.6±5.1）岁,产次（1.5±0.5）次,孕前BMI（23.2±3.5）kg/m2;晚发型子痫前期组胎盘标本（late onset severe preeclampsia,LOSP,8例,孕周≥34周）,年龄（28.9±3.0）岁,产次（1.3±0.4）次,孕前BMI（20.9±2.5）kg/m2;另外选取同期血压正常的单胎晚期孕妇（normotensive pregnant women,NT,10例）为对照组,年龄（31.2±4.0）岁,产次（1.8±0.4）次,孕前BMI（21.0±2.4）kg/m2。标本于-80℃保存。Western Blot法检测胎盘标本中焦亡相关分子caspase1、Cleaved caspase1、GSDMD、IL-1β蛋白水平的表达,探究滋养细胞焦亡与子痫前期发病机制的相关性,并分析其在子痫前期不同发病阶段中表达的临床意义。2.H2O2诱导滋养细胞HTR-8/Svneo焦亡模型的建立本研究选用人滋养细胞系HTR-8/SVneo,设置H2O2（100μM、150μM、200μM、250μM）处理滋养细胞不同时间（2h、4h、6h、12h）,Western Blot法检测caspase1、Cleaved caspase1、GSDMD、IL-1β蛋白水平的表达;RT-q PCR法检测NLRP3、caspase-1、GSDMD、IL-1β及IL-18的m RNA水平;光镜及透射电镜下观察经H2O2处理后滋养细胞形态学改变。3.小剂量阿司匹林抑制滋养细胞焦亡分子机制的初步探讨在H2O2诱导滋养细胞HTR-8/SVneo焦亡模型构建成功的基础上,设置阿司匹林（1m M、5m M）处理滋养细胞不同时间（8h、20h）,紧接着用H2O2（150μM）再处理滋养细胞4h,Western Blot检测NLRP3、caspase-1、Cleaved caspase1、NF-κB p65及p-NF-κB p65（phospho S536）蛋白水平的表达;RT-q PCR检测NLRP3、caspase-1、GSDMD、IL-1β及IL-18的m RNA水平;光镜下观察H2O2诱导滋养细胞HTR-8/Svneo焦亡模型组提前用小剂量阿司匹林干预处理后的形态学改变。结果1.胎盘标本中检测到滋养细胞焦亡通路的激活,滋养细胞焦亡程度与患者的年龄、产次及孕前BMI之间无相关性,差异无统计学意义（p>0.05）;早发型子痫前期组胎盘组织caspase1、Cleaved caspase1、GSDMD、IL-1β的蛋白水平较正常妊娠组及晚发型子痫前期组中均高,差异有统计学意义（p<0.05）;滋养细胞焦亡程度:EOSP>LOSP;晚发型子痫前期组caspase1、Cleaved caspase1、GSDMD、IL-1β的蛋白水平与正常妊娠组相比差异无统计学意义（p>0.05）。2.H2O2诱导滋养细胞系HTR-8/SVneo发生焦亡损伤模型的最佳条件是150μM和4h。在该条件下,滋养细胞NLRP3、caspase1、Cleaved caspase1、GSDMD、IL-1β的蛋白水平均高于对照组;与对照组相比,NLRP3、caspase1、GSDMD、IL-1β及IL-18的m RNA水平均上调,且具有统计学意义（p<0.05）;光镜下见细胞肿胀、碎裂及质膜气泡形成等细胞焦亡典型改变;透射电镜下可见细胞骨架稳定性破坏、核仁皱缩、核膜褶皱明显、染色质断裂、细胞表面伪足数量明显减少、胞质中的大型细胞器由胞内向胞外移动。3.对滋养细胞焦亡模型组提前用小剂量阿司匹林进行干预后,NLRP3、caspase-1、Cleaved caspase1、NF-κB p65及p-NF-κB p65（Ser536）的蛋白水平明显被抑制;同时NLRP3、caspase-1、GSDMD、IL-1β及IL-18的m RNA水平明显下调,且具有统计学意义（p<0.0001）。光镜下观察到细胞形态趋于正常,外形呈多边形,紧密排列,边界清晰可见,核浆比例明显。结论1.临床标本研究显示滋养细胞焦亡与早发型子痫前期的发病机制具有相关性,滋养细胞焦亡程度与子痫前期不同发病阶段的病情严重程度呈正相关;2.H2O2诱导滋养细胞HTR-8/Svneo焦亡模型的最佳条件是150μM和4h,体外实验成功构建氧化应激反应诱导滋养细胞焦亡模型;3.阿司匹林抑制滋养细胞焦亡的最佳条件是:5m M和12h;4.阿司匹林可抑制NF-κB表达及其Ser536磷酸化,通过NF-κB-GSDMD信号通路抑制H2O2诱导的滋养细胞焦亡。