白化小麦基因定位与SSH文库的构建

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小麦是世界上最重要的粮食作物之一,其生物、经济产物主要由光合作用而来。叶绿素是植物光合作用的重要色素,一些基因位点的突变会影响叶绿素的变化,导致植物的叶色发生变化。小麦白化突变体是研究高等植物的光合作用、叶绿素生物合成、叶绿体发育等机理的重要材料。白化小麦突变体材料的研究,对阐明光合作用机制、提高作物的光合效率,从而增加作物产量等方面具有重要的理论与应用意义。本文研究了一个从小麦品种川农19中发现的白化突变体M6,对它与正常野生型川农19之间的杂交后代F1和F2代进行了遗传分析,并通过DNA提取、PCR及聚丙烯酰胺凝胶电泳,SSR分子标记等技术手段,筛选了一些多态性标记对白化基因进行基因定位。同时我们同样以小麦白化突变体M6和川农19作为材料,采用高灵敏的抑制消减杂交技术构建了正反向差异基因文库。筛选出了阳性克隆,分析了差异ESTs序列,为进一步的光合机理研究奠定了基础。主要的结果如下:1.以白化M6与川农19为材料进行杂交,其子代F1全部为绿色,说明白化性状由隐性基因控制,F2正反交均发生了叶色的性状分离,经卡方检验绿色与白色的分离比符合3:1的比例,说明白化性状由一对隐性核基因控制。2.利用Xgwm和Xwmc两套小麦SSR分子标记,采用SSR标记定位技术,对白化M6、川农19亲本以及正反交F2群体的基因组DNA进行PCR扩增和聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。最终经F2代群体遗传连锁性检测发现,7BL上的标记Xwmc557, Xwmc581,Xgwm611,Xcfa2040的扩增位点与白化基因连锁,这4个标记叶色性状的基因型和分子的基因型比例均符合1:2:1的分离比例。使用了软件joinmap4.0绘制了白化基因定位遗传图谱,标记顺序依次为Xgwm611, Xwmc557, Xwmc581, Xcfa2040。标记之间遗传距离分别为1.3cM,0.4cM,2.1cM,8.0cM,白化基因定位于标记Xwmc581和Xcfa2040之间。3.以M6和CN19为材料,提取纯化了两个材料的mRNA,构建了正、反向抑制消减杂交的cDNA文库。正向cDNA文库以白化M6为tester, CN19为driver。反向SSHcDNA文库以CN19为tester,白化M6为driver。结果表明正向文库一共得到27条有效ESTs序列,其中17条为已知功能序列或编码产物高度相似序列,10条ESTs为未知功能且无相似序列,全部都为单拷贝序列。有3条ESTs定位于小麦7BL上,1条EST定位于7同源群7AS上。光合、代谢相关序列占26%,物质转运4%,转录调控有11%,抗逆/机体防御相关有22%,未知功能37%。反向文库一共得到35条有效ESTs序列,其中24条为已知功能序列或编码产物高度相似序列,11条为未知功能序列,6条为多拷贝序列,29条单拷贝序列,4条有相似序列但无功能相关信息,1条EST定位于7BL上。49%的ESTs序列与光合、代谢相关,信号传导相关有6%,转录调控有3%,细胞生长/凋亡有11%,其余的功能未知,对光合相关EST序列进行了初步分析。
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