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目的采用清湿化瘀功效的院内制剂(内异康复片)治疗子宫腺肌病小鼠,以雌孕激素效应相关因子ERα、ERβ、PR-A、PR-B、GPER、Akt、p-Akt、NF-κB为研究靶点,观察子宫内膜局部雌孕激素效应相关因子在用药前后、疾病发展的不同时期及随动情周期变化的表达差异,以期探索清湿化瘀法治疗子宫腺肌病的作用机制。方法运用同种异体垂体移植的方法建立子宫腺肌病小鼠模型。将造模小鼠随机分成3月模型组、6月模型组、内异康复片(NYK)高、中、低剂量组、丹莪妇康煎膏组(DE,中药对照组)、孕三烯酮组(GN,西药对照组)。另设假手术组及空白对照组。每组24只小鼠。常规饲养3个月后,将3月模型组、假手术组、空白组小鼠分别在动情期或间情期处死。其余用药组小鼠再连续灌胃相应不同浓度的药物3个月,6月模型组继续常规饲养3个月后分别在动情期或间情期处死。应用real-time PCR及western blot技术检测小鼠子宫内膜局部ERα、ERβ、PR-A、PR-B、GPER、Akt、p-Akt、NF-κB基因及蛋白的表达情况。结果(1)子宫腺肌病病理机制研究结果:(正常组、假手术组、3月模型组、6月模型组之间比较)① ERα、ERβ、PR-A、PR-B、GPER、Akt、p-Akt、NF-κB的表达在正常组与假手术组差异无统计学意义(P>0.05)。;② ERα、ERβ、PR-A、PR-B、GPER、Akt、p-Akt、NF-κB在6月模型组和3月模型组均显著高于正常组及假手术组(P<0.05)。③造模后,动情期和间情期ERα、ERβ、GPER、Akt、p-Akt、NF-κB的基因及蛋白表达在6月模型组均显著高于3月模型组,差异有统计学意义(P<0.05)。④造模后,动情期和间情期PR的基因及蛋白表达在6月模型组均显著低于3月模型组(P<0.05)。⑤无论在3月模型组还是6月模型组,ERα、ERβ、GPER、Akt、p-Akt、NF-κB的基因及蛋白表达在动情期显著高于间情期(P<0.05)。⑥无论在3月模型组还是6月模型组,PR的基因及蛋白在表达在间情期显著高于动情期(P<0.05)。(2)内异康复片药效机理研究结果:(假手术组、6月模型组、各治疗组之间比较)① ERα基因及蛋白表达相比同期6月模型组,内异康复片高剂量组、中剂量组、丹莪妇康煎膏组和孕三烯酮组显著低于6月模型组(P<0.05)。各用药组间相比,内异康复片高剂量组、中剂量组、丹莪妇康煎膏组和孕三烯酮组动情期和间情期均显著减少(P<0.05),并且在内异康复片高剂量组显著低于丹莪妇康煎膏组和孕三烯酮组(P<0.05)。② ERβ基因及蛋白表达相比同期6月模型组,内异康复片高剂量组、中剂量组、丹莪妇康煎膏组和孕三烯酮组显著低于6月模型组(P<0.01)。各用药组间相比,ERβ蛋白在内异康复片高剂量组、中剂量组、丹莪妇康煎膏组和孕三烯酮组动情期和间情期均显著减少(P<0.01),并且在内异康复片高剂量组显著低于丹莪妇康煎膏组和孕三烯酮组(P<0.01)。③ PR-A基因及蛋白表达相比同期6月模型组,内异康复片高剂量组、中剂量组、丹莪妇康煎膏组和孕三烯酮组动情期和间情期均显著增加,并且在内异康复片高剂量组显著高于丹莪妇康煎膏组和孕三烯酮组(P<0.05)。④ PR-B基因及蛋白表达相比同期6月模型组,内异康复片高剂量组、中剂量组、丹莪妇康煎膏组和孕三烯酮组动情期和间情期均显著增加,并且在内异康复片高剂量组显著高于丹莪妇康煎膏组和孕三烯酮组(P<0.05)。⑤ GPER基因及蛋白表达相比同期6月模型组,内异康复片高剂量组、中剂量组、丹莪妇康煎膏组和孕三烯酮组显著低于6月模型组(P<0.05)。各用药组间相比,GPER蛋白在内异康复片高剂量组、中剂量组、丹莪妇康煎膏组和孕三烯酮组动情期和间情期均显著减少(P<0.05),并且在内异康复片高剂量组显著低于丹莪妇康煎膏组和孕三烯酮组(P<0.05)。⑥ Akt基因及蛋白表达相比同期6月模型组,Akt在内异康复片高剂量组、中剂量组、丹莪妇康煎膏组和孕三烯酮组动情期和间情期均显著减少,并且在内异康复片高剂量组显著低于丹莪妇康煎膏组和孕三烯酮组(P<0.05)。⑦ p-Akt基因及蛋白表达相比同期6月模型组,内异康复片高剂量组、中剂量组、丹莪妇康煎膏组和孕三烯酮组动情期和间情期均显著减少,并且在内异康复片高剂量组显著低于丹莪妇康煎膏组和孕三烯酮组(P<0.05)。⑧ NF-κB基因及蛋白表达相比同期6月模型组,内异康复片高剂量组、中剂量组、丹莪妇康煎膏组和孕三烯酮组动情期和间情期均显著减少,并且在内异康复片高剂量组显著低于丹莪妇康煎膏组和孕三烯酮组(P<0.05)。⑨动情期与间情期比较:在本实验用western-blot法检测雌激素效应相关因子中,在各治疗组及6月模型组中,ERα、ERβ、GPER、PR、Akt各治标的表达无论是在位内膜和异位内膜上均随着动情周期不同阶段而发生变化,除了PR-B在丹莪妇康煎膏和孕三烯酮组中动情期与间情期比较无统计学意义,其他指标在各组的动情期与间情期比较均有统计学意义;除孕激素受体(PRA、PRB)是间情期的表达显著高于动情期外,其余皆为动情期的表达显著高于间情期。结论1.AM的发生与子宫内膜雌孕激素受体及其通路的异常表达有关,本研究结果表明ERα、ERβ的过高表达,尤其是ERα的表达增加了雌激素对子宫内膜腺体及间质细胞的反应,同时GPER作为雌激素跨膜受体,其介导的雌激素快速基因组效应可激活Akt通路,使PI3K/Akt/m TOR信号通路调控作用异常,而激活的PI3K/Akt通路又可以促进NF-κB的活化,造成局部雌激素水平过高,促进内膜细胞的增殖和浸润作用,抑制正常的细胞凋亡作用;而PR受体亚型的低表达,尤其是PR-B蛋白的不足,孕激素活化转录作用减弱,孕激素不能充分发挥其正常作用,而PR-A蛋白的减少使其不能充分抑制ERα的转录活化作用,故孕激素拮抗雌激素的作用减弱,使内膜细胞过度生长并容易在子宫肌层而存活,从而导致AM的发生。2.清湿化瘀法方药内异康复片可通过降调子宫内膜上雌激素核、膜受体,抑制通路的表达,以降低雌激素对子宫内膜腺体及间质细胞的增殖作用;同时上调孕激素受体的表达,以增强孕激素拮抗雌激素的效能;如此核膜共调、双向靶控调节雌激素效应相关受体的表达,从而改善异常的雌激素效应。3.高剂量内异康复片在调控雌激素效应相关因子方面优于孕三烯酮和丹莪妇康煎膏。内异康复片灵活应用藤类药、虫类药、泻下药,体现了开通郁闭之玄府,畅达阻滞络脉,使邪气有出路的络病学说和玄府理论的治疗大法。为中医药治疗AM提供了一种新的思路的方法,值得深入研究与推广。4.雌激素效应相关因子的表达受激素的调节,随激素的变化而发生周期性的变化,且雌激素效应在动情期高于间情期,因此,这将为临床上治疗AM选择最佳用药时间提供依据。