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背景:实体肿瘤通过新生血管为其生长提供营养和转移途径,遏制血管形成可抑制肿瘤生长。新生血管形成在实体瘤及多种疾病中起关键作用,是药物治疗的良好靶点。新型的脊椎类模式生物斑马鱼已经逐渐取代传统动物模型,用于筛选和评估血管形成抑制剂。斑马鱼的优势在于:与人类基因、生理、病理机制的高度同源性;斑马鱼胚胎透明容易观察药物对其体内血管形成的影响;斑马鱼实验成本小,周期短,操作简单。而特异性荧光蛋白标记血管内皮的转基因斑马鱼为活体动态研究肿瘤血管形成带来了福音。贝伐单抗可通过拮抗血管内皮生长因子而阻断血管形成。贝伐单抗的抗血管形成治疗可诱导肿瘤血管正常化,逆转肿瘤内结构和功能异常的新生血管,改善肿瘤微环境的组织间隙高压、低氧和酸中毒,提高化疗药物的运输和治疗效率。少数研究指出贝伐单抗等抗血管形成抑制剂诱导的血管正常化存在一定的时间窗,在这个时间窗内联合化疗可达到最大化抑制肿瘤效应。目的:本研究的第一部分通过构建斑马鱼模型,首次研究贝伐单抗对斑马鱼胚胎血管形成的作用,以期通过贝伐单抗应用的安全性和疗效的观察数据,为临床上贝伐单抗的应用提供依据。第二部分实验目的在于探索抗血管形成治疗诱导血管正常化的时间窗。确定血管正常化时间窗有利于临床治疗中最佳化联合给药方案的拟定。方法:研究的第一部分选用血管内皮细胞特异性标记的转基因斑马鱼为实验动物,以血管内皮生长因子受体为抗血管形成的靶点,利用体式荧光显微镜活体观察斑马鱼新血管形成。实验分为对照组(PBS组)及贝伐单抗组,贝伐单抗的注射剂量选择:1mg/ml组及2mg/ml组(PBS稀释),每组80条胚胎。选择卵黄囊作为药物的注射部位,因为进入卵黄囊的大分子蛋白可以被胚胎摄取并通过胚胎体循环代谢。鉴于胚胎肠下静脉和视网膜新血管形成的时间不同,分别选择2.5dpf-3dpf及2.5dpf-4dpf作为给药时间窗。采用斑马鱼胚胎躯干的节间血管ISVs和肠下静脉丛SIVs作为评估斑马鱼血管形成抑制的主要指标。斑马鱼胚胎经尼康SMZ 1500体式荧光显微镜分析并依次拍照。使用尼康显微图像分析软件NIS-ElementsD3.1对这些图像进行定量分析。实验数据用均数±标准差表示。数据的统计分析和图形化表示使用GraphPad 5.0软件。统计显著性使用t检验或方差分析进行统计分析。*表示p<0.05,***表示p<0.0001。研究的第二部分选用肺癌细胞系A549裸鼠皮下成瘤模型。根据每批实验小鼠需要的数目,购置3-4周大小的雄性裸鼠,经紫外线照射灭菌处理,分笼进入SPF级别动物房。一周后,于每只裸鼠右季肋部接种5×10~5细胞悬液(约100ul),对照组在相应部位注射等体积的1×PBS。实验共两部分:(一)24只雄性裸鼠,A549皮下接种成瘤后,每隔一天用游标卡尺测量瘤体最长径(a)和最短径(b),按公式计算肿瘤体积V(mm3)=1/6πab~2,待瘤体平均体积达约150mm3时,随机分组,实验组12只,贝伐单抗5mg/kg腹腔给药(day0)。对照组12只,给予相应体积生理盐水处理。于给药后的第一天(day1),第三天(day3),第5天(day5)及第8天(day8)分别处死3只实验鼠及3只对照鼠。取下瘤体,分别测量长短径,计算体积,称重。PBS洗一遍,直接放入包埋剂中,液氮速冻,-80℃保存备用。(二)30只雄性裸鼠,A549细胞皮下接种成瘤后,每隔一天用游标卡尺测量瘤体最长径(a)和最短径(b),按公式计算肿瘤体积V(mm3)=1/6πab~2,待瘤体平均体积约达80mm3时,随机分6组:贝伐单抗5mg/kg单药组,紫杉醇3mg/kg单药组,贝伐单抗5mg/kg(day0)与紫杉醇3mg/kg(day0,day3,day5)不同时间联合给药组,对照组给予相应体积生理盐水处理。均采用腹腔注射,连续三周,21天后全部处死。取下瘤体,分别测量长短经,计算体积,称重。PBS洗一遍,放入10%中性福尔马林中固定24h。梯度酒精(75%1h,85%1h,95%40min×2,100%30min×2)脱水,二甲苯I、II浸润透明、浸蜡,包埋。实验数据用均数±标准差表示。数据的统计分析和图形化表示使用GraphPad 5.0软件。统计显著性使用t检验或方差分析进行统计分析。*表示p<0.05,***表示p<0.0001。结果:本研究选用斑马鱼为模型,首次在斑马鱼上验证了贝伐单抗抑制血管形成作用。同时,通过选择合适的作用时间窗,在斑马鱼胚胎2.5dpf-3dpf给予贝伐单抗处理,此时贝伐单抗只抑制肠下静脉SIVs的形成,而对已经形成的躯干血管如节间血管ISVs没有影响,这一研究结果或可为临床上贝伐单抗应用的安全性提供有利的证据。同时,贝伐单抗作为抗血管形成药物不仅应用于肿瘤治疗,在其他以血管形成为特征的疾病中的作用也逐渐得到重视。本实验首次利用斑马鱼为模型,证实了贝伐单抗在抑制斑马鱼视网膜新血管形成具有明确的效果,可为临床治疗以新血管形成为基本特征的眼部疾患提供一个新的可靠的动物模型。研究的第二部分,基于血管正常化理论,我们初步证实了在贝伐单抗给药后的第一天至第三天内联合紫杉醇使用对裸鼠皮下瘤的抑制效果最好,此时,肿瘤内VEGF的表达含量及微血管密度达到最少。这一实验结果或可为临床治疗中贝伐单抗联合化疗最佳化联合给药方案的拟定提供参考价值。