随着养禽业迅速发展,各类细菌性疾病日益严重,特别是大肠杆菌病一直是限制养禽业发展的最主要的疾病之一。为建立一种特异性的禽大肠杆菌病检测方法,本实验根据GeneBank收录的APEC毒力基因papC、iucD、tsh、irp2、iss序列的保守区,设计并合成5对特异性引物,建立一种同时检测APEC 5种毒力基因的多重PCR方法,并应用此方法检测APEC安徽分离株的毒力基因。结果如下:1.APEC中papC、iucD、irp2、tsh、iss单基因PCR扩增根据APEC的致病机理,从细菌的粘附定居、参与铁摄取和增强血清抗性等方面考虑,参照GeneBank收录的禽致病性大肠杆菌P型菌毛基因papC、产气杆菌素基因iucD、温度敏感性血凝素基因tsh、铁抑制蛋白基因irp2、血清抗性蛋白基因iss的序列,设计并合成5对特异性引物。以E.coli O₁（CVCC249）、O₂（CVCC1565）、O₇₈（CVCC1555）标准菌株的DNA为模板,将5种基因分别进行单基因PCR扩增,以筛选多重PCR的阳性对照。经过预实验得到的PCR反应体系包括:10×PCR缓冲液2.5μL,MgCl₂（25mM）3.0μL,dNTP（10mM）1.0μL,引物各0.5μL（10pmol）,Taq DNA聚合酶(5U·μL^-1)0.4μL,DNA模板2.0μL,加灭菌超纯水至25μL。PCR反应参数为:94℃预变性3min,94℃变性30s,58℃退火30s,68℃延伸3min,共进行30个循环,最后72℃延伸10min。结果3种血清型的菌株中5种基因的检出率均为100%,因此均可用做阳性对照的模板。选择其中一种血清型菌株E.coliO₂（CVCC1565）,对从中扩增出的5种基因进行核苷酸序列测定,并提呈NCBI BLAST 2 SEQUENCES,与GeneBank中公布的进行基因同源性分析。结果显示所得的片段与预计的基本一致,且同源性在98%～99%。2.APEC中papC、iucD、irp2、tsh、iss多重PCR方法的建立根据单基因PCR扩增条件,通过逐步优化引物组合浓度、镁离子浓度、TaqDNA聚合酶量、退火温度、延伸时间、循环次数和DNA模板提取方法等条件,建立了同时检测5种毒力基因的多重PCR方法。所建立的多重PCR反应体系为25μL,包括2.5μL 10×PCR缓冲液,2.5μL MgCl₂（25mM）,1.0μL dNTP（10mM）,0.5μL引物（10pmol）,0.5μL Taq DNA聚合酶(5U·μL^-1),2.0μL DNA模板,加灭菌超纯水至25μL。PCR反应参数为:94℃预变性3min,94℃变性30s,58℃退火30s,68℃延伸3min,共进行30个循环,最后72℃延伸10min。菌液最低检出浓度为10² cfu·mL^-1,且具有特异性。3.APEC安徽分离株毒力基因的多重PCR检测应用所建立的多重PCR方法检测了9株APEC安徽分离株,以验证所建立的多重PCR方法的实用性,并确定了9株APEC安徽分离株的毒力基因型。分别提取各分离株的基因组DNA作为模板,进行papC、tsh、iucD、irp2和iss基因的多重PCR扩增。结果1株鸭源和3株鸡源的APEC中均扩增出4条毒力基因条带,1株鹅源和4株鸡源的APEC中均扩增出5条毒力基因条带。在9株APEC安徽分离株中iss、irp2、papC和iucD基因的携带率均为100%,tsh基因的携带率为55.6%。9株APEC安徽分离株分布于两个毒力基因型,其中5株为iss⁺irp2⁺papC⁺iucD⁺tsh⁺,占55.6%;4株为iss⁺irp2⁺papC⁺iucD⁺tsh^-,占44.4%。表明iss、irp2、papC和iucD基因广泛存在于APEC中。以上研究表明,本文建立的多重PCR方法可从APEC分离菌株中检测出任何一种或任何组合的毒力基因,其特异性强,准确性好,敏感度可以达到10²cfu·mL^-1。因此,本方法在禽大肠杆菌病的早期诊断、分子流行病学调查和禽制品APEC污染的检测中具有重要的应用价值,为进一步从分子水平揭示APEC的致病机制提供研究基础。