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目的壮医用药“国虾薄”,又名绞股蓝,主要含有皂苷类、黄酮类、多糖类、氨基酸类等化学成分。具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗病毒等功效。本研究对绞股蓝中的黄酮成分进行分离、鉴定,并评价绞股蓝黄酮清除自由基的能力和体外抗氧化活性,分析其构效关系。以期为由氧化损伤引起的肾脏疾病提供潜在的候选药物,并为临床合理用药提供理论依据。方法1.利用80%乙醇加热回流提取绞股蓝,采用硅胶柱色谱、SP825L大孔树脂等方法富集绞股蓝总黄酮,通过反相色谱、硅胶柱色谱及凝胶色谱等方法,分离和纯化绞股蓝中的黄酮类化合物,并通过UV、MS、NMR等波谱数据对绞股蓝黄酮进行结构鉴定。2.采取DDPH自由基清除模型、超氧自由基清除模型和羟自由基清除模型,评价绞股蓝黄酮的体外抗氧化活性。3.采用不同浓度AAPH诱导猪肾小管上皮细胞LLC-PK1,建立氧化损伤模型,采用不同浓度绞股蓝黄酮修复10 h,用MTT法筛选修复氧化损伤活力最强的绞股蓝黄酮。采用DCFH-DA荧光探针法测定细胞内ROS水平,NBT法测定细胞内SOD活力,DTNB法测定GSH的含量。结果1.从绞股蓝中分离得到10个单体黄酮类化合物,并根据其MS和NMR数据对其结构进行鉴定。鉴定出7个化合物,分别为槲皮素-3-0-(2",6"-二-α-L-鼠李糖基)-β-D-吡喃半乳糖苷(I)、槲皮素-3-O-(2",6"-二-α-L-鼠李糖基)-β-D-吡喃葡萄糖苷(Ⅱ)、槲皮素-3-O-(2"-α-L-鼠李糖基)-β-D-吡喃半乳糖苷(Ⅲ)、槲皮素-3-0-(2"-α-L-鼠李糖基)-β-D-吡喃葡萄糖苷(Ⅳ)、山奈酚-3-O-新橙皮糖苷(Ⅵ)、金丝桃苷(Ⅸ)、异槲皮苷(Ⅹ)。由于Ⅴ、Ⅶ和Ⅷ化合物质量很少,根据其MS数据推测了 3个化合物的结构为山奈酚-鼠李糖基-六元糖苷(Ⅴ)、山奈酚-六元糖苷(Ⅶ、Ⅷ)。其中Ⅰ和Ⅱ,Ⅲ和Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ、Ⅶ和Ⅷ、Ⅸ和X互为同分异构体,并且Ⅰ-Ⅲ为葫芦科中首次发现的化合物。2.绞股蓝黄酮化合物Ⅰ-Ⅳ对DPPH自由基的清除能力与其浓度、作用时间呈依赖性关系,清除DPPH自由基的能力不同,IC50分别为71.4、29.5、48.3、79.2 μM,其中槲皮素-3-0-(2",6"-二-α-L-鼠李糖基)-β-D-吡喃葡萄糖苷清除能力最强,其次是槲皮素-3-0-(2"-α-L-鼠李糖基)-β-D-吡喃半乳糖苷。在清除·OH自由基能力中化合物Ⅰ-Ⅳ IC50分别为403.6、396.8、358.1、481.9μM,其中槲皮素-3-0-(2",6"-二-α-L-鼠李糖基)-β-D-吡喃葡萄糖苷与槲皮素-3-O-(2"-α-L-鼠李糖基)-β-D-吡喃半乳糖苷较强。四个化合物清除O2-自由基的能力较弱。3.用30 mM AAPH刺激猪肾小管上皮细胞LLC-PK1作用10 h建立氧化损伤模型,细胞存活率为69.8%左右。采用绞股蓝黄酮Ⅰ-Ⅳ在50μ浓度修复10 h后,使AAPH氧化损伤的LLC-PK1细胞的存活率提高到97.7%、102.8%、107.7%、105.9%。4.经过绞股蓝黄酮化合物Ⅰ-Ⅳ修复AAPH损伤的LLC-PK1细胞后,细胞内ROS含量从117分别下降到53.6、40.5、49.2、56.7,细胞内SOD活力由5.62 U/g分别上升到6.39、10.73、8.09、7.46 U/g(p<0.05)、GSH含量由4.25 mmol/g分别上升到5.53、6.33、8.48、7.12 mmol/g(p<0.05)。结论从绞股蓝中分离得到10个黄酮类化合物,并且是5对同分异构体,鉴定出其中7个化合物结构,它们在体外均具有很强的清除DPPH自由基的能力,并通过降低AAPH氧化损伤LLC-PK1细胞引起的ROS含量及提高SOD、GSH表达水平,减轻细胞氧化损伤,具有一定的修复作用,对氧化损伤引起的肾脏疾病提供依据。