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肺癌是目前对人类的健康和生命危害最大的恶性肿瘤之一。迄今为止,现有的肺癌治疗方法仅可延长患者的生存期,改善其生活质量,几乎所有的患者最终仍死于原发病。近年来有学者提出,在肿瘤组织中存在极小一部分具备无限增殖潜能和自我更新能力的干细胞群体,对肿瘤的发生、发展起着至关重要的作用,针对这部分细胞的靶向治疗将会给肿瘤治疗带来深远影响。但由于肿瘤干细胞(cancer stem cells, CSCs)在肿瘤组织中的含量极少,这成为制约CSCs研究发展的主要障碍。因此,建立一种高效的富集CSCs方法,对后续实验研究的顺利进行非常必要,也是目前CSCs领域研究的重要课题之一。目的:①探讨人肺癌细胞系A549中是否存在具有肿瘤干细胞。②探讨能否利用CSCs对常规化疗药物相对耐药的特性,在无血清富集CSCs法的基础上采用联合顺铂(DDP)短期处理的方法,更加方便、有效地从人肺癌细胞系A549中分离鉴定出肿瘤干细胞。方法:分组:亲代A549细胞组;单纯无血清培养的CSCs组;无血清培养联合顺铂筛选的细胞组(Drug-selected cells,DSCs)。①将细胞以5000个细胞/的密度接种至添加无血清培养液(serum free medium, SFM)的6孔板中,观察细胞形态变化。②采用有限稀释法将细胞以10个细胞/孔的密度接种至96孔板,检测单个细胞在SFM条件下的成球能力。③通过Cell Counting Kit-8(CCK-8)实验分别检测各组细胞的自我更新和分化能力及对顺铂作用24h后的耐受能力。④通过Hoechst 33342荧光染料进行细胞染色,利用FASC BD Aria II流式细胞仪建立Hoechst blue-Red分析图,检测侧群(side population,SP)表型细胞含量。将添加Hoechst 33342转运子活性阻断剂——利血平作用后减少的区域设定为SP的“门”,比较“门”中的SP细胞含量。结果:①药物筛选后的A549细胞形态变化:亲代A549细胞经过3个周期终浓度为7μg/ml的顺铂处理后,原本成多边形致密排列的细胞形态发生改变,细胞变得大且扁平,表面颗粒增多。②细胞的自我更新及分化能力比较:通过用倒置显微镜连续观察2周SFM中的单个细胞成球情况,我们发现DSCs在SFM条件下第3天即可形成肺肿瘤球(CSCs在第5天开始形成),且形成的悬浮球体积更大,数量更多;CCK-8实验结果表明,DSCs组中具备自我更新及分化能力的细胞较CSCs组中增加2倍。③细胞对顺铂的耐药能力比较:通过CCK-8实验检测各组细胞在顺铂作用24h后的凋亡情况,利用SPSS 17.0软件分析结果显示,DSCs较CSCs对药物顺铂表现出更高的耐药性(IC50值为66.52±2.49μg/ml vs. 37.82±0.39μg/ml),两者较对照组亲代A549细胞(IC50值10.81±0.39μg/ml)的耐药性分别提高了6倍和3.5倍(P<0.01)。④各组细胞中的SP细胞含量比较:Hoechst blue-Red分析图结果显示,三组的SP细胞含量具有明显差异,DSCs较CSCs的SP细胞含量明显增多(12.32±1.51% vs.7.93±1.44%),两者较对照组亲代A549细胞(1.29±0.48%)的SP细胞含量分别增加了12倍和8倍(P<0.01)。结论:①人肺癌细胞系A549中存在具有自我更新及分化能力并高度耐药的肿瘤干细胞。②同常规无血清培养法相比,无血清培养联合顺铂筛选法可以更加有效地从人肺癌细胞系中分离培养出肺癌干细胞。