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【目的】肿瘤的发生发展是一非常复杂的病理生理过程，涉及多阶段多因素参与，发生机制仍然不明确，许多研究表明BIRC5选择性高表达于多种肿瘤组织，与肿瘤的分化程度、浸润深度、淋巴结转移、高复发率和病人的低生存率相关，而在正常组织低表达或不表达，沉默其表达可作为诱导肿瘤细胞凋亡的策略。然而通过单独沉默BIRC5的表达诱导肿瘤细胞凋亡并未取得十分满意的效果。近期研究证明，肿瘤发生过程中，肿瘤细胞异常高表达OCT4以对维持肿瘤细胞的干性特征，并促进肿瘤的耐药、复发及转移。OCT4主要功能是维持胚胎干细胞特性及其自我更新的功能，阻止肿瘤细胞分化，越来越多的研究证明，OCT4不仅存在于胚胎干细胞及生殖细胞肿瘤，在体细胞肿瘤中，其与肿瘤的分化程度、淋巴结转移及低生存率也密切相关。本课题组前期研究证明，OCT4在食管鳞癌组织中呈现团块状的阳性表达，虽阳性率不高，但却与肿瘤发展密切相关。在此基础上本项研究拟联合检测了OCT4和BIRC5在食管鳞癌的组织标本和肿瘤细胞系中的表达，构建沉默OCT4和BIRC5的双干扰shRNA质粒，探讨沉默肿瘤细胞OCT4和BIRC5基因协同诱导肿瘤细胞凋亡的效应及其相互调控的分子机制。【方法】1.免疫组化法：50例临床食管鳞癌组织、癌旁组织、正常食管粘膜上皮组织标本石蜡包埋、切片，检测OCT4和BIRC5的表达，分析其表达与临床病理特征及预后的关系；2.干扰质粒载体构建：根据Gene Bank设计OCT4和BIRC5mRNA的干扰序列，采用分子克隆技术构建特异性沉默OCT4、BIRC5及沉默OCT4/BIRC5双干扰shRNA，所有质粒均带增强型GFP基因作为荧光标记，分别命名为OCT4-shRNA、BIRC5-shRNA，Dual-RNA，无关对照质粒为Ctr-shRNA；3.细胞转染：用LipofectamineTM2000将OCT4-shRNA、BIRC5-shRNA，Dual-RNA，Ctr-shRNA分别转染食管鳞癌细胞株Eca109、TE1，转染48h后收集细胞检测，荧光显微镜观察GFP表达；4.免疫组化检测OCT4与BIRC5在食管鳞癌细胞系Eca109、TE1中的表达。收集体外培养的细胞，细胞爬片后用兔抗人BIRC5/鼠抗人OCT4和羊抗兔二抗/羊抗鼠二抗孵育，用显微镜观察盖玻片上细胞的OCT4和BIRC5表达；5. MTT实验：细胞转染48后，进行MTT染色，用酶联测定仪在490nm波长检测每孔的光密度值（OD值），检测细胞增殖率＝（实验管OD值/对照管OD值）×100％；6. FCM测定肿瘤细胞凋亡与周期：细胞转染48h后，收集细胞，FCM检测肿瘤细胞的凋亡与周期变化。利用Cell Quest软件进行参数获取和资料分析；7. RT-PCR检测转染细胞胞内OCT4和BIRC5的表达：提取细胞总RNA，逆转录cDNA， PCR检测OCT4-shRNA、BIRC5-shRNA，Dual-RNA，Ctr-shRNA等干扰质粒转染细胞后OCT4和BIRC5mRNA的表达情况；8. Western Blot：细胞转染后，PMSF裂解细胞，提取细胞总蛋白，分离、转膜后，用鼠抗人单克隆IgG抗体/羊抗BIRC5单克隆IgG抗体,辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG二抗/辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG二抗检测OCT4-shRNA、BIRC5-shRNA，Dual-RNA、Ctr-shRNA转染细胞后OCT4和BIRC5蛋白的表达情况；9.激光免疫荧光共聚焦显微镜观察转染后OCT4和BIRC5的表达：转染48hr后，细胞爬片，中性甲醛固定，用兔抗人BIRC5/鼠抗人OCT4一抗和FITC标记的羊抗兔二抗/Cy3标记羊抗鼠二抗孵育，激光免疫荧光共聚焦显微镜观察盖玻片上细胞OCT4/BIRC5的表达；【结果】1.食管鳞癌组织中OCT4和BIRC5的表达：免疫组化检测结果显示，OCT4主要着色于细胞核，BIRC5主要定位于细胞浆，并且癌组织的阳性比例均明显高于癌旁组织，差异具有统计学意义(P<0.01)；2. OCT4与BIRC5的表达无显著相关性（R=0.276, P>0.05）；OCT4、BIRC5表达阳性率与性别、年龄、分化程度、淋巴结转移、侵犯深度无显著性差异（P>0.05）；OCT4、BIRC5共同阳性的患者预后最差，OCT4、BIRC5全阴性的患者预后最好；3.食管鳞癌细胞株Eca109、TE1中OCT4与BIRC5阳性的表达，OCT4主要定位于细胞核，BIRC5主要表达于胞浆；4.成功构建干扰RNA：OCT4-shRNA、BIRC5-shRNA，Dual-shRNA、Ctr-shRNA通过酶切鉴定表明载体构建成功；5.干扰RNA抑制细胞增和诱导细胞凋亡：OCT4与BIRC5的shRNA质粒转染人食管鳞癌细胞株Eca109、TE1后，MTT法检测细胞增殖、FCM检测细胞凋亡与细胞周期，结果显示，OCT4-shRNA、BIRC5-shRNA均可抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡，但Dual-RNA诱导细胞凋亡效果更明显（(P<0.01)）。6. OCT4和BIRC5相互调控的分子机制：沉默BIRC5基因表达后，RT-PCR、WesternBlot、激光免疫荧光共聚焦显微镜检测OCT4、BIRC5蛋白或mRNA，发现BIRC5mRNA或蛋白表达下调后，OCT4基因的表达无明显变化，但是沉默OCT4基因，OCT4与BIRC5的表达量同时下调。【结论】OCT4和BIRC5在食管癌鳞癌组织中表达显著高于癌旁组织，在食管鳞癌细胞株中Eca109、TE1中也呈阳性表达，OCT4主要定位于细胞核，BIRC5主要表达于细胞浆，两种基因阳性表达均是食管鳞癌预后的不良因素；OCT4、BIRC5的shRNA质粒能够有效沉默相应靶基因表达，抑制肿瘤细胞增殖和诱导肿瘤细胞凋亡；双靶向干扰RNA能够更有效沉默Eca109、TE1细胞中OCT4和BIRC5基因的表达，抑制肿瘤细胞增殖和诱导细胞凋亡的效应最强，二者具有协同效应；沉默OCT4能够同时下调食管鳞癌细胞内OCT4和BIRC5基因表达，但沉默BIRC5，OCT4表达不受影响，因此，OCT4通过调控靶基因BIRC5的表达，共同促进癌细胞增殖。本项研究为食管癌的分子靶向治疗提供了有力的分子靶标。