背景与目的:银屑病的一个重要特点是表皮角质形成细胞增殖加速,凋亡减少,细胞有丝分裂周期缩短,表皮更替时间缩短。研究表明,角质形成细胞不仅参与了银屑病的发生,还可与免疫细胞相互作用,共同参与银屑病的进一步发展及复发过程。因此,探索角质形成细胞异常增殖的机制及抑制策略并实现临床转化可能会对银屑病治疗有一定的价值。细胞分裂周期蛋白37（Cdc 37）是细胞周期相关蛋白,具有伴侣分子活性,可以介导多种蛋白激酶与热休克蛋白（HSP）90的结合,形成Cdc37-HSP90复合体,保护蛋白激酶免于降解,在细胞内的多项生命活动中都起着重要的作用。HSP90在银屑病皮损中高表达,被认为参与了银屑病的发病。有研究表明Cdc37在肿瘤组织和一些良性疾病中均存在表达升高,然而Cdc37在银屑病角质形成细胞中的表达及作用机制尚未被报道。故本研究首先将通过数据库检索和临床样本免疫组化检测,验证Cdc37在银屑病患者皮损中的表达情况;然后将进一步观察Cdc37表达改变对人角质形成细胞增殖、细胞周期及凋亡的影响;最后将探究Cdc37发挥功能的潜在分子机制。紫草在临床中被作为中药方剂用来治疗银屑病,紫草素是中药紫草的主要活性成份,具有抗肿瘤、抗病毒和抗炎等多种生物学活性。迄今为止,已有多项基础研究证实了其干预银屑病的有效性,但目前紫草素尚未在临床中使用,仍需要更多的研究来为其临床应用的有效性和安全性提供依据。课题组的前期研究结果表明紫草素可以抑制角质形成细胞的增殖并诱导其凋亡。也有研究表明紫草素能够调控Cyclin A、Cyclin B、Cyclin D、Cyclin E、CDK1、CDK2等与Cdc37存在相互作用的周期相关蛋白来抑制人结直肠癌、子宫内膜癌、乳腺癌等肿瘤细胞的增殖。但目前尚无紫草素与银屑病角质形成细胞细胞周期相关因子的研究。本研究将从体内和体外两个方面探索紫草素是否能够影响Cdc37引起的角质形成细胞异常改变,并探索其可能的作用靶点,试图为阐明银屑病的发病机制和紫草素的临床应用提供科学依据。研究方法:1.本研究首先通过生物信息学分析,在GEO数据库中进行检索,选取同时检测银屑病患者皮损处、非皮损处和正常人皮肤组织的数据集,通过统计分析得出银屑病患者皮损处、非皮损处及健康对照组人群皮肤中Cdc37m RNA的表达量是否存在差异。再通过收集临床病理诊断后的皮肤蜡块,用免疫组织化学染色的方法观察银屑病患者皮损与对照组人群皮肤中Cdc37蛋白水平的表达量的差异及其在皮肤各层分布情况的差异。2.细胞实验研究Cdc37的作用及机制:慢病毒转染人永生化角质形成细胞（Ha Ca T细胞）,构建Cdc37过表达的细胞模型LV-Cdc37,RT-q PCR和Western Blot技术验证转染效率;HSP90抑制剂17-AAG构建Cdc37-HSP90复合物抑制的细胞模型。在成功构建细胞模型的基础上,探索Cdc37表达变化对角质形成细胞增殖、周期及凋亡的影响,具体为:CCK-8法检测细胞增殖速度;Ed U法检测处于增殖期的细胞比例;流式细胞技术检测不同组间的细胞周期及凋亡的变化。之后结合KEGG数据库中的信号通路图谱及银屑病的相关研究进展,推测Cdc37在角质形成细胞中可能的作用机制,用Western Blot技术验证通路蛋白分子的表达差异,在此基础上使用位点抑制剂处理细胞后,再次使用Western Blot技术来明确Cdc37发挥作用的关键靶点。3.体内和体外实验研究紫草素对Cdc37/Akt信号通路的作用:CCK-8法检测紫草素对LV-Cdc37细胞增殖速度的影响;Ed U法检测紫草素干预后LV-Cdc37处于增殖期的细胞比例;流式细胞术检测紫草素干预后LV-Cdc37细胞的细胞周期、凋亡的改变;Western Blot技术验证相关蛋白分子的表达变化。动物试验部分用咪喹莫特诱导的银屑病样小鼠模型验证紫草素对银屑病皮损的改善作用;用Western Blot技术验证细胞实验中的相关蛋白分子在动物模型中的表达变化。结果:1.银屑病患者与健康对照组皮肤组织中Cdc37的表达差异:通过筛选得到两个符合要求的数据集,统计分析的结果显示银屑病患者皮损处Cdc37m RNA的表达量较非皮损处和正常人皮肤组织中的表达量明显增加,银屑病患者非皮损处和正常人皮肤组织的Cdc37m RNA表达量未见明显差异。临床收集到的银屑病患者及正常对照组皮肤组织的免疫组化结果显示,Cdc37表达于正常对照皮肤组织的基底层细胞,而在银屑病患者的皮损中,Cdc37不仅表达于基底层,还表达于棘层细胞,用Image Pro-Plus 6.0量化后比较也提示银屑病患者皮损中Cdc37的表达量显著高于正常对照组。2.Cdc37可以通过Akt影响角质形成细胞的增殖、周期及凋亡:CCK-8的结果显示与野生型Ha Ca T细胞相比,过表达Cdc37的LV-Cdc37细胞从第3天开始增殖明显加快,而17-AAG可以抑制LV-Cdc37细胞的增殖速度。Ed U的结果显示LVCdc37细胞Ed U阳性细胞比例明显升高,代表处于增殖期的细胞比例明显升高,而加入不同浓度的17-AAG可以使增殖期的细胞比例减少。流式细胞术的结果显示与空载病毒转染的EV细胞相比,过表达Cdc37的LV-Cdc37细胞G1期细胞比例减少,S期和G2/M期的细胞比例均增加,细胞凋亡比例明显减少;加入10n M的17-AAG作用72h后G1期细胞比例增加,S期和G2/M期的细胞比例均减少,细胞凋亡细胞的比例明显增加。Western Blot测通路蛋白的结果显示与空载病毒转染的EV细胞相比,过表达Cdc37的LV-Cdc37细胞中p-Akt、Cyclin D1、Bcl-x L表达升高,BAD蛋白表达减少,而Akt、p-ERK1/2、CDK4/6、Cyclin D2、Cyclin D3、Bcl-2和C-casp-9蛋白水平均未见明显差异。为了进一步明确Akt的激活是否为Cdc37发挥作用的关键调控点,本实验使用Akt磷酸化位点的抑制剂MK2206处理LV-Cdc37细胞后再次用Western Blot检测相关蛋白的表达变化,结果显示p-Akt、Cyclin D1、Bcl-x L表达减少,BAD的表达升高。3.紫草素在体内外对Cdc37/Akt信号通路的影响:CCK8和Ed U的结果显示紫草素（0.5μM或1μM）处理LV-Cdc37细胞72h后,可以使LV-Cdc37细胞增殖活性减弱。流式细胞术的结果显示,紫草素（1μM）处理LV-Cdc37细胞72h后,LV-Cdc37细胞的G1期细胞比例增加、S期和G2/M期的细胞比例均减少,且凋亡细胞的比例明显增加。Western Blot检测相关通路蛋白的表达变化,结果显示紫草素并未对Cdc37的表达产生影响,但可以呈浓度依赖性显著减少Akt及下游p-Akt、Cyclin D1、Bcl-x L的蛋白表达,并能显著增加BAD蛋白的表达。体内实验显示紫草素可以显著改善小鼠皮损的严重程度,Western Blot结果显示其在体内可能通过减少Akt蛋白的表达,并能减少其磷酸化来发挥作用,与细胞实验结果一致。结论:1.与正常人皮肤组织比较,Cdc37在银屑病患者皮损中表达升高。2.在HaCaT细胞系中,Cdc37与HSP90结合后,以Akt为关键调控点,通过促进Akt的磷酸化,进一步增加Cyclin D1的表达和差异化调节Bcl-2家族蛋白（Bclx L和BAD）的表达,最终起到加快角质形成细胞增殖、抑制凋亡和促使细胞由G1期向S期转变的作用。3.紫草素通过减少Akt蛋白的表达,减少其磷酸化,进而调控下游蛋白分子Cyclin D1、Bcl-x L和BAD的表达,最终抑制了过表达Cdc37引起的角质形成细胞增殖加速、减少了从G1到S期转变的细胞比例、诱导了细胞凋亡,并改善了小鼠银屑病皮损的严重程度。