[研究背景和目的]心脏是哺乳动物胚胎发育过程中形成的第一个功能性器官,心脏发育异常导致各种心脏疾病。阐明人类心脏发育的机制,将有助于揭示心脏疾病的病因和发病机制,为心脏再生治疗提供线索。几十年来,啮齿类动物模型在探究人类心脏发育生物学和疾病等方面做出了重要贡献,但种间的本质差异使得基于啮齿类动物的结果无法准确反映人类的结果,从而无法直接将其转化到临床应用。人类多能干细胞（human pluripotent stem cells,hPSCs）,尤其是源自体细胞重编程技术的诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells,iPSCs）,提供了用之不竭的细胞来源,为研究人类心脏发育、心血管疾病的发病机制以及基于细胞治疗的心脏再生领域提供了前所未有机遇。hPSCs能定向分化为各心脏谱系,体外重现体内心脏发育的一些重要的步骤。然而,当前大多数心脏谱系的定向分化方案是采用单层细胞贴壁分化,所形成的细胞类型单一,并不能反映真实器官和组织的三维复杂性,忽略了其他非心肌细胞（比如心外膜、心脏成纤维细胞等）对心脏发育的贡献,即使是3D悬浮培养,也未能形成有结构的心脏组织,所以难以对心脏发育过程中的组织形态发生过程进行模拟。类器官是源自干细胞或器官特异性祖细胞、通过自我组装形成的3D复合体,其在一定程度上可以模拟真实器官的组织结构和功能特征,所以在理解人类器官发育、疾病模拟以及再生医学方面具有空前的优势。迄今为止,利用类器官作为发育模型,已经解码了很多器官发育过程中的关键事件,然而,既往对人心脏类器官的研究,均未形成类似体内心脏样的结构。因此,本研究拟利用人多能干细胞在体外构建心脏类器官,建立一种既能够跨越物种差异,又能在体外有效模拟人早期胚胎心脏发育的新模型,从而为研究人类心脏发育和心脏疾病建模提供一个强有力的平台。[方法]本研究的科学问题是如何利用人多能干细胞在体外构建心脏类器官,围绕该科学问题,需要解决三个关键的问题,首先明确心脏发育早期的细胞谱系构成,其次,建立稳定的心脏谱系细胞体外分化体系,最后,构建心脏类器官培养体系。因此,本研究拟从以下几个方面开展研究。第一部分:收集4例流产胎儿样本,获取完整心脏组织,3例样本消化后获得了单细胞,进行建库和10x genomics单细胞测序,对测序结果进行生物信息学分析,明确心脏发育早期的细胞谱系构成,其余1例进行HE和免疫荧光染色。第二部分:收集包皮环切术后废弃包皮组织,通过组织块贴壁法获取皮肤成纤维细胞,采用重编程技术生成iPSCs,采用碱性磷酸酶染色、免疫荧光染色、流式细胞术等方法检测iPSC的多能性,使用G显带核型分析法分析iPSC核型,用畸胎瘤形成实验检测iPSCs的多向分化潜能。继而采用改良“GiWi”方案,建立稳定的iPSC-CM分化体系,使用qRT-PCR等方法检测分化过程中基因的表达情况,采用免疫荧光染色、流式细胞术对心肌细胞分化效率进行评估,并对心肌细胞进行鉴定,采用膜片钳技术检测心肌细胞的电生理功能。第三部分:采用免疫荧光染色,识别心肌细胞分化过程中心血管前体细胞NKX2-5和ISL1的表达情况,选择NKX2-5和ISL1高表达的阶段,使用CHIR99021再次激活Wnt信号通路,诱导细胞部分分化成心外膜谱系细胞,继而混合NKX2-5、ISL1以及WT1的细胞构建自组装的外膜化心脏类器官,并进行培养体系优化,采用免疫荧光染色检测类器官的细胞组成。[结果]第一部分首次成功绘制了发育中期胚胎完整心脏的转录图谱:3个心脏样本分别捕获细胞数为8075、9095、13992,对应的每个细胞的平均reads数为40833、36359、21346,每个细胞的中位基因数为1565、1702、1213。在严格质控过滤后,我们分别保留4916、5719、8311个细胞用于随后的转录组分析,平均在每个单细胞中检分别测到2751、2821、2065个基因。最终我们定义了胚胎心脏8个主要的细胞类型和15个亚细胞类型,首次鉴定了胎儿心脏淋巴细胞群,还纠正了先前研究中鉴定错误的心内膜细胞类群,我们的研究提供了迄今为止人类胚胎心脏较为完整的单细胞转录图谱。第二部分成功建立iPSC定向心肌细胞分化体系:通过组织块贴壁法获取了活性较好的皮肤成纤维细胞,进而用仙台病毒转染细胞进行重编程,碱性磷酸酶染色证实在重编程过程中形成了类似胚胎干细胞（embryonic stem cells,ESCs）样的细胞克隆,通过挑选克隆,最终我们选择生长较好的一株细胞进行鉴定及后续研究（命名为B12-6）,免疫荧光染色、流式细胞术检测多能性基因或蛋白OCT4、SOX-2、NANOG、SSEA4及Tra160等均高表达,经传代培养20代以后细胞核型正常,畸胎瘤形成实验证实B12-6具有较好的三胚层分化能力,因此,我们将其用于构建心肌细胞分化体系。采用改良“GiWi”方案,通过调控Wnt信号通路,成功将B12-6高效诱导分化成可搏动的心肌细胞,分化效率接近90%,分化过程中收样行qRT-PCR检测,证实分化过程中基因的表达情况类似体内心脏发育过程,分化后的心肌细胞免疫荧光提示高表达心肌特异性蛋白cTnT及α-actinin-4。第三部分成功构建外膜化的心脏类器官:通过对分化过程中不同天数的细胞进行免疫荧光染色,我们确定分化的第9天高表达心血管前体细胞NKX2-5和ISL1。通过再次激活Wnt信号通路,采用免疫荧光染色和qRT-PCR结果证实,NKX2-5+和ISL1+细胞被部分诱导成表达WT1和TBX18的心外膜谱系细胞。在分化的D11收获细胞后在96孔U型板让细胞自我组装成跳动的心脏微组织,免疫荧光染色证实其具有心外膜和心肌结构,类似真实心脏的心外膜层和心肌层。为了进一步探索我们所构建的心外膜类器官是否可在体外模拟上皮间质细胞转换（epithelial to mesenchy-mal transition,EMT）过程,我们将其贴壁培养,在培养过程中,可见类器官周围有大量细胞迁出,免疫荧光染色证实,这些细胞包括血管平滑肌细胞、血管内皮细胞和心脏成纤维细胞,高度类似心外膜衍生细胞。[结论]1.我们采用整个胚胎心脏消化的方式,利用scRNA-seq技术,定义了胚胎心脏8个主要的细胞类型和15个亚细胞类型,首次鉴定了胎儿心脏淋巴细胞群,还纠正了先前研究中鉴定错误的心内膜细胞类群,我们的研究提供了迄今为止人类胚胎心脏较为完整的单细胞转录图谱,为后续心脏类器官的构建提供了指导。2.通过改良的“GiWi方案”,我们成功建立了 B12-6细胞系定向CM分化体系,该体系无需添加任何细胞因子和生长因子,即可高效产生心肌细胞,而且分化过程和体内心脏发育过程类似,因此,可用于体外模拟心脏发育,亦可为后续试验奠定基础。3.我们识别了心肌细胞分化过程中心血管前体细胞高表达的阶段,选择该阶段的心血管前体细胞构建了人外膜化心脏类器官,该模型可能是研究人类心脏发育和CHD病因的有价值的工具,鉴于心外膜在心脏再生领域的重要作用,该模型还有可能用来体外模拟心脏再生。