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大黄鱼是我国重要的网箱养殖经济鱼类之一,目前各种病害频繁发生阻碍了大黄鱼养殖业的可持续发展,其中尤以鳗弧菌引起的败血症对规模化养殖构成较大威胁。本课题组前期采用无标记缺失突变技术,成功构建了新型鳗弧菌减毒活疫苗MVAV 6203,其特点是在消除鳗弧菌内源性毒力质粒的基础上敲除了染色体上aroC基因,使之在营养缺陷条件下难以存活。本工作将上述鳗弧菌减毒活疫苗免疫大黄鱼,构建了疫苗免疫后大黄鱼诱导前后差异表达基因的抑制性差减杂交文库,对该文库中随机挑取的300个克隆经PCR鉴定、斑点杂交筛选和DNA测序,共得到179个阳性克隆。序列分析表明,94个基因与GenBank己知的功能基因有较好的同源性,编码了39个基因,其中18个基因为免疫应答相关基因；37个基因与GenBank中未知功能的基因同源；而剩余的48个基因则未找到任何同源性片段。并且该差减文库筛选到的大多数基因在大黄鱼中都未有文献报道。进一步对大黄鱼补体系统的相关基因进行了克隆鉴定和功能相关研究。首先克隆了大黄鱼补体因子Bf／C2A和Bf／C2B的全长cDNA,其开放阅读框(Open reading frame, ORF)分别为2259 bp和2295 bp。同源比对和系统进化树分析显示前者与已报道的青鳉补体Bf／C2因子的亲缘关系最近,后者与已报道的鲤鱼补体Bf／C2B因子的亲缘关系最近,同时两者间的同源性也达28.8%。功能结构域预测发现,两者具有相似的结构域,均包括三个补体调节蛋白结构域(CCP),一个范德华A结构域(vWFA):和一个丝氨酸蛋白酶结构域。系统进化树分析和功能结构域中二硫键和糖基化位点的分布特点表明,补体因子Bf／C2A更接近于哺乳动物的补体C2,而Bf／C2B则更接近于补体B因子。荧光定量PCR的结果显示在鳗弧菌减毒活疫苗免疫后,大黄鱼的肝脏、脾脏和肾脏组织中补体因子Bf／C2A和Bf／C2B的表达量均有不同程度的上调,说明其在大黄鱼的免疫应答中起到重要作用。克隆得到了大黄鱼补体C1抑制因子(C1INH),其cDNA全长为2046 bp,编码一599个氨基酸的蛋白。进化树分析显示大黄鱼补体C1抑制因子与虹鳟的补体C1抑制因子形成一个簇。结构预测表明大黄鱼补体C1抑制因子具有两个低同源性的免疫球蛋白(Ig)结构域和一个相对保守的丝氨酸蛋白酶抑制剂结构域。原位杂交和半定量Western blotting的结果显示在鳗弧菌减毒活疫苗免疫后,大黄鱼的肝脏、脾脏和肾脏组织中补体C1抑制因子的表达均有不同程度的提高,说明补体C1抑制因子也可能在大黄鱼的免疫应答中起重要作用。而体外表达的大黄鱼补体C1抑制因子全长蛋白可以粘附鳗弧菌,间接说明其在同细菌的相互作用中具有一定的功能。最后克隆得到了大黄鱼凝血酶原类似基因的全长cDNA序列,并将其氨基酸序列与其它动物的凝血酶原类似基因进行了同源性及进化树分析,考察了其在鳗弧菌减毒活疫苗免疫前后各个组织中的表达差异,发现其在免疫后的脾脏和肾脏组织中有上调表达,说明凝血酶原类似基因在大黄鱼对细菌的免疫应答中也起到一定作用。综上所述,首次对鳗弧菌减毒活疫苗免疫大黄鱼前后的表达差异基因进行了筛选和鉴定,对多个免疫相关基因功能的初步研究及其在疫苗免疫前后的表达变化分析将有助于对大黄鱼免疫系统的理解及未来的健康养殖。