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透明带3(ZP3)是哺乳动物卵透明带四种成份之一,系卵母细胞分泌的糖蛋白,仅存在哺乳动物卵子外膜上.顶体反应(AR)是精子质膜与顶体外膜囊泡化过程,是精子与卵子受精的前提.ZP3的主要功能是诱导精子顶体反应,在哺乳动物受精过程精卵识别、结合以及受体介导的信号传导中均起关键作用.鉴于这些重要功能,ZP3已经用于男性不育的诊断和避孕疫苗的开发.但由于人卵子来源有限以及伦理学的限制,研究者们采用基因重组的方法在多种表达系统中表达ZP3.本文主要研究用大肠杆菌热诱导系统表达的人卵透明带3肽段rhuZP3a<22～176>和rhuZP3b<177～348>的生物学性质. 目的：探讨用大肠杆菌重组表达的人卵透明带3肽段rhuZP3a<22～176>和rhuZP3b<177～348>的生物学性质,研究rhuZP3a<22～176>和rhuZP3b<177～348>能否诱发人精子顶体反应进而探讨它们的机制.
方法：
1.rhuZP3a<22～176>和rhuZP3b<177～348>诱发人精子顶体反应精子首先与培养基HTF.等量混匀后,500×g离心15分钟,然后,沉淀重新悬浮于1ml HTF中,再用90﹪和45﹪Percoll间断密度梯度600×g离心15分钟,所得沉淀用大约10倍体积HTF重新悬浮,300×g离心5分钟.弃去上清液,再用IITF调整精子密度到2～3×10<7>cells/ml.然后精子在37℃孵育5小时使其获能.然后进行分组,分别加入等体积溶剂、可溶性天然ZP、不同浓度的rhuZP3a<22～176>和rhuZP3b<177～348>孵育15分钟,用金霉素染色法(CTC staining)对rhuZP3a<22～176>和rhuZP3b<177～348>诱发人精子顶.
2.PTX抑制rhuZP3a<22～176>和rhuZP3b<177～348>诱发的顶体反应获能精子加入,2 μg/ml特异的Gi蛋白抑制剂白同咳毒素(PTX),孵育10分钟,同时以PTX的溶剂(DMSO)标本作为对照.然后,分别加入rhuZP3a<22～176>和rhuZP3b<177～348>孵育15分钟,用金霉素染色法评价rhuZP3a<22～176>和rhuZP3b<177～348>诱发人精子顶体反应.
3.EGTA对rhuZP3a<22～176>和rhuZP3b<177～348>诱发顶体反应的影响获能精子加入2mM钙离子螯合剂EGTA,孵育10分钟,同时以EGTA的溶剂标本作为对照,再分别加入rhuZP3a<22～176>和rhuZP3b<177～348>孵育15分钟,用金霉素染色法评价人精子顶体反应.
4.PIM对rhuZP3a<22～176>和rhuZP3b<177～348>诱发的项体反应的影响获能精子加入100 gM T型钙通道抑制剂PIM孵育10分钟,同时以PIM的溶剂标本作为对照,分别加入rhuZP3a<22～176>和rhuZP3b<177～348>孵育15分钟,用金霉素染色评价人精子顶体反应.
5.rhuZP3a<22～176>和rhuZP3b<177～348>刺激获能精子[Ca<2+>]i变化经分离洗涤的精子在37℃培养4.5小时,加入2 μM荧光染料Fura2/AM,在黑暗环境下37℃孵育30分钟.然后,以培养基HTF离心5分钟(300×g),洗涤3次,除去多余的Fura2/AM.以HTF调整精子密度为10x10<6>cells/ml, 样本荧光强度用Shimadzu RF-540荧光分光光度计测量,在激发波长340nm和380nm(发射波长为510nm)条件下进行交替分析,测量速度为1次/40秒.在测量过程中,分别加入rhuZP3a<22～176>或rhuZP3b177～348铝.[Ca<2+>]i浓度以F340/F380比值来表示.
6.EGTA和PIM对rhuZP3a<22～176>和rhuZP3b<177～348>诱发获能精子[Ca<2+>]i变化的影响培养4.5小时后精子与2μM荧光染料Fura2/AM孵育30分钟,精子用HTF洗涤后,将其密度调至约为10x10<6>cells/ml,然后分组,在测定样本荧光强度前,分别加入2mM EGTA和100μM PIM, 37℃孵育10分钟,用Shimadzu RF-540荧光分光光度计在激发波长340nm和380nm(发射波长为510nm)条件下进行交替测量,用1次/40秒的速度进行.在测量过程中,精子用rhuZP3a<22～176>或rhuZP3b<177～348>处理.[Ca<2+>]i浓度以F340/F380比值来表示.
结果：
不同浓度rhuZP3a<22～176>或rhuZP3b<177～348>均可诱导人精子AR.其中rhuZP3a<22～176>诱导人精子AR呈浓度依赖方式.PTX、EGTA和PIM可分别抑制rhuZP3a<22～176>或rhuZP3b<177～348>诱导的顶体反应.rhuZP3a<177～348>和rhuZP3b<177～348>可以刺激获能人精子[Ca<2+>]i升高,但rhuZP3a<22～176>诱发[Ca<2+>]i升高的方式与rhuZP3b<177～348>诱发[Ca<2+>]i升高方式不尽相同,rhuZP3a<22～176>只能引起[Ca<2+>]i峰值(peak),而rhuZP3b<177～348>既有[Ca<2+>]i峰值,又有持续的平台期(plateau).rhuZP3a<22～176>和rhuZP3b<177～348>刺激获能精子[Ca<2+>]i升高可被EGTA和PIM抑制.
结论：
rhuZP3a<22～176>和rhuZP3b<177～348>诱导AR与人天然ZP3具有相似性,其机制是通过激活精子Gi蛋白和T型钙通道,使胞外Ca<2+>内流引起精子[Ca<2+>]i上升,从而导致AR的发生.