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目的:通过短发夹RNA重组慢病毒载体靶向沉默SKM-1细胞株中SPAG6的表达,并构建小鼠异体移植瘤模型,明确SPAG6表达差异和地西他滨处理对PTEN基因启动子甲基化在体内外的影响,以期为MDS的治疗提供新的靶点。方法:1.慢病毒载体转染SKM-1细胞构建SPAG6-/-细胞模型:根据课题组前期研究确定慢病毒载体的序列,慢病毒SPAG6-sh RNA和NC-sh RNA分别转染SKM-1细胞,荧光显微镜镜下观察转染后SKM-1细胞的绿色荧光的表达情况,流式细胞术检测转染率,利用q RT-PCR和western blot验证SPAG6沉默效果。2.探讨SPAG6沉默对PTEN表达和启动子甲基化的影响:MSP检测5种血液系统恶性疾病的细胞株和SPAG6沉默和过表达组中PTEN的启动子甲基化情况,western blot和q RT-PCR检测SPAG6-sh RNA和NC-sh RNA组的PTEN和甲基化相关的基因的表达。3.探讨SPAG6沉默和去甲基化药物地西他滨对SKM-1细胞凋亡和存活率的影响:SKM-1细胞用不同浓度的地西他滨处理72h或组蛋白去乙酰化酶抑制剂LBH589处理48h,流式细胞术检测SKM-1细胞的凋亡率,利用CCK-8检测细胞药物处理后OD值计算细胞存活率,western blot检测凋亡相关蛋白的表达。4.明确SPAG6沉默和地西他滨处理对SKM-1细胞中PTEN的启动子甲基化的影响:Western blot检测不同浓度地西他滨处理后PTEN的表达和甲基化调控相关蛋白的表达,后分组地西他滨/地西他滨联用LBH589处理NC-sh RNA或SPAG6-sh RNA,共6组,western blot检测各组的PTEN表达,MSP检测PTEN启动子甲基化水平。5.探讨SPAG6沉默和地西他滨处理对SKM-1细胞的凋亡和PTEN去甲基化的体内影响:构建NOD/SCID小鼠异体移植瘤模型,观察小鼠荷瘤后肿瘤的生长情况,western blot检测肿瘤组织中甲基化相关的指标和PTEN表达情况,MSP检测不同处理组中PTEN启动子甲基化的水平,免疫组化检测小鼠肿瘤组织PTEN、SPAG6和DNMT1的表达情况。结果:1.SPAG6-/-的SKM-1细胞模型被成功构建,转染后3天,流式细胞术检测转染率,阴性对照组和干扰组均大于80%。Western blot和q RT-PCR结果提示干扰组的SPAG6的蛋白和m RNA水平均较对照组降低,表明SPAG6被成功沉默。2.SPAG6基因沉默后,SKM-1细胞中干扰组的PTEN蛋白和m RNA水平的表达上调,同时发现甲基化相关DNMT1、DNMT3A和MBD2表达降低,而DNMT3B和Me CP2的表达无明显差异;MSP结果提示PTEN启动子在K562、THP-1、HL60、HEL和SKM-1细胞株中呈现高甲基化状态,且在SKM-1中SPAG6沉默能够一定程度上降低PTEN的启动子甲基化。3.地西他滨和LBH589不同药物浓度处理SKM-1细胞后,CCK-8结果提示两种药物均可降低细胞的存活率,流式细胞术检测凋亡结果提示地西他滨和LBH589可诱导细胞凋亡,且随着药物浓度增加而凋亡率升高,western blot结果提示地西他滨处理后Caspase-3、Cleaved Caspase-3和Cleaved PARP、Bad表达上调,Bcl2表达降低,而PARP表达无明显变化,提示SPAG6沉默可能增加地西他滨的凋亡诱导作用。4.地西他滨不同浓度处理后SKM-1细胞中PTEN的表达量增加,而DNMT1、DNMT3A和DNMT3B的表达量则降低,MSP结果提示LBH589单药处理对PTEN启动子甲基化无明显作用,而地西他滨单独使用或联用LBH589则能明显降低PTEN启动子的甲基化水平,同时SPAG6沉默和LBH589能够增加地西他滨诱导的DNMT表达降低的程度和PTEN去甲基化的水平。5.分离小鼠异体移植瘤的肿瘤组织,计算体积,结果提示干扰组的肿瘤体积较阴性对照组小,而地西他滨处理组的肿瘤体积小于安慰剂组,且经地西他滨处理后的干扰组肿瘤组织体积未各组中最小。免疫组化的结果提示地西他滨处理组和干扰组的PTEN表达升高而DNMT1的表达降低。而western blot检测结果提示地西他滨处理组的Caspase-3、Cleaved Caspase-3、PTEN表达增加,而DNMT1、DNMT3A和DNMT3B的表达降低;小鼠肿瘤组织的MSP结果提示地西他滨能够降低PTEN启动子的甲基化程度,而SPAG6沉默联合地西他滨处理组的PTEN去甲基化水平明显低于两者单独作用。结论:SPAG6基因沉默可以增加抑癌基因PTEN的表达,地西他滨处理可以增加SKM-1细胞的凋亡且降低PTEN的启动子甲基化水平,而SPAG6沉默联合地西他滨处理的促凋亡和PTEN去甲基化作用明显优于二者单独作用,且在体内实验中SPAG6沉默联合地西他滨表现出更强的抗肿瘤特性,表明SPAG6沉默联合地西他滨治疗可能为MDS治疗提供新的思路。