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第一部分吸烟与非吸烟患者心肌组织纤维化程度以及iNOS与NLRP3表达差异目的:吸烟是心血管疾病的独立危险因素。目前还没有临床数据及文献支持吸烟诱发心肌纤维化。本部分主要检测吸烟与非吸烟患者心肌组织纤维化程度以及筛选表达差异的蛋白,寻找心肌纤维化有关的潜在研究靶点。方法:（1）收集于2021年06月至2021年09月之间在重庆医科大学附属第一医院心胸外科接受心脏外科手术的患者的右心耳组织。共收集到10例患者的右心耳组织,根据患者的吸烟史分为吸烟组（n=5）和非吸烟组（n=5）。Masson染色显示吸烟和非吸烟患者心肌组织中胶原纤维沉积情况。（2）使用免疫组化检测吸烟和非吸烟患者心肌组织中iNOS与NLRP3表达情况。（3）使用Western Blot方法检测吸烟和非吸烟患者心肌组织中iNOS与NLRP3表达情况。结果:（1）吸烟患者的心肌组织中胶原纤维Masson染色阳性率（21.40±3.43）%较非吸烟患者（5.612±2.15）%明显增多,差异有统计学意义。（2）免疫组化的结果显示:在吸烟患者心肌组织中的iNOS（29.22±5.28）%和NLRP3（44.95±4.38）%阳性着色率明显高于非吸烟患者心肌组织中iNOS（5.21±1.86）%和NLRP3（7.30±1.90）%阳性着色率。（3）Western Blot结果显示:与非吸烟者相比,iNOS与NLRP3在吸烟者心肌组织中的表达明显升高。结论:吸烟患者心肌组织中胶原沉积较非吸烟患者明显增多,并且iNOS与NLRP3在吸烟和非吸烟患者心肌组织中差异表达,提示iNOS与NLRP3可能是研究吸烟相关的心肌纤维化的潜在靶点。第二部分CS暴露诱导iNOS表达促进心肌纤维化发生目的:持续烟草烟雾（Cigarette Smoke;CS）暴露导致机体产生无菌性炎症反应,而炎症反应是导致心肌纤维化的重要原因之一。诱导型一氧化氮合酶（iNOS）,在多种炎症因子刺激下可以被激活,进而参与调控心肌纤维化。本部分主要探究iNOS在CS暴露引起的心肌纤维化中的作用。方法:（1）将C57BL/6小鼠和iNOS敲除(iNOS-/-)小鼠分为C57BL/6野生型（WT）组、C57BL/6 CS暴露组（CS）、iNOS-/-小鼠组(iNOS-/-)、iNOS-/-小鼠CS暴露组(CS+iNOS-/-),每组4只。CS组和CS+iNOS-/-组中小鼠暴露于CS中,而WT组和iNOS-/-组中小鼠置于相同环境下的空气中。使用小动物心功能超声探测仪检测小鼠的心功能,Masson染色显示小鼠心肌组织中胶原纤维沉积情况,Western Blot检测蛋白表达情况。（2）体外培养乳鼠心肌成纤维细胞,外源性给予烟草烟雾提取物（cigarette smoke extract,CSE）与乳鼠心肌成纤维细胞共培养。检测不同浓度和时间的CSE处理后,乳鼠心肌成纤维细胞中iNOS、a-SMA、Collagen I和Collagen III的表达情况。使用L-NIL（iNOS抑制剂）对乳鼠心肌成纤维细胞进行预处理1h,再给予CSE共培养24h,使用Western blot检测iNOS、a-SMA、Collagen I和Collagen III的表达情况。结果:（1）在CS组中小鼠左心室的射血分数（LVEF）及左室短轴缩短分数（LVFS）逐渐下降,于第4周时CS组小鼠LVEF（61.10±2.85）%和LVFS（32.44±1.31）%均明显低于Control组LVEF（84.87±1.22）%和LVFS（46.74±0.89）%。（2）CS组中小鼠心肌组织中胶原纤维Masson染色阳性着色率（12.37±1.66）%较Control组（1.20±0.25）%明显增多。（3）与Control组比较,CS组小鼠心肌组织中iNOS、a-SMA、Collagen I和Collagen III蛋白表达水平明显升高（P＜0.05）。（4）CS+iNOS-/-组小鼠心功能逐渐下降,于第4周时LVEF（72.94±1.14）%和LVFS（42.41±0.78）%明显优于CS组LVEF（61.10±2.85）%和LVFS（32.44±1.31）%。（5）CS+iNOS-/-组小鼠心肌组织中胶原纤维Masson染色阳性着色率（1.99±0.39）%明显低于CS组（12.37±1.66）%。与对照组（WT）、iNOS-/-组和CS+iNOS-/-组相比,CS+WT组中小鼠心肌组织中iNOS、a-SMA、Collagen I和Collagen III蛋白表达水平明显升高（P＜0.05）。（6）体外实验发现,CSE可诱导iNOS、a-SMA、Collagen I和Collagen III蛋白表达水平呈浓度-时间依耐性升高,而L-NIL（iNOS抑制剂）可显著逆转CSE诱导的iNOS、a-SMA、Collagen I和Collagen III蛋白水平升高。结论:CS暴露导致小鼠心功能下降,心肌纤维化以及iNOS、aSMA、Collagen I和Collagen III蛋白水平升高,但iNOS敲除可显著改善CS暴露引起的心功能下降和心肌纤维化,此外在乳鼠心脏成纤维细胞中,使用iNOS抑制剂（L-NIL）干预,可逆转CSE诱导的iNOS、a-SMA、Collagen I和Collagen III蛋白水平升高。这些结果提示CS暴露诱导小鼠心肌成纤维细胞中iNOS表达,促进小鼠心肌纤维化,进一步引起心功能下降。第三部分烟草烟雾暴露诱导NLRP3炎性小体激活促进心肌纤维化发生目的:NLRP3炎性小体作为固有免疫的重要组分在炎症反应中发挥着核心作用。已有研究报道CS暴露可以引起NLRP3炎性小体激活,但尚不清楚是否参与CS暴露诱发心肌纤维化的过程。本部分实验主要探究NLRP3炎性小体在CS暴露引起的心肌纤维化中的作用。方法:将C57BL/6小鼠和NLRP3敲除(NLRP3-/-)小鼠分为C57BL/6野生型（WT）组、C57BL/6CS暴露组（CS）、NLRP3-/-小鼠组(NLRP3-/-)、NLRP3-/-小鼠CS暴露组(CS+NLRP3-/-),每组4只。CS组和CS+NLRP3-/-组中小鼠暴露于CS中,而WT组和NLRP3-/-组中小鼠置于相同环境下的空气中。使用小动物心功能超声探测仪检测小鼠的心功能,Masson染色显示小鼠心肌组织中胶原纤维沉积情况,Western Blot检测蛋白表达情况。体外培养乳鼠心脏成纤维细胞,外源性给予不同浓度的CSE刺激乳鼠心脏成纤维细胞不同时间。检测乳鼠心脏成纤维细胞中NLRP3、a-SMA、Collagen I和Collagen III的表达情况。使用MCC950（NLRP3抑制剂）对乳鼠心肌成纤维细胞进行干预,再给予1.5%CSE共培养24h,使用Western blot检测NLRP3、a-SMA、Collagen I和Collagen III的表达情况。结果:（1）WT组和NLRP3-/-组中小鼠的心功能无明显变化,而CS+WT组和CS+NLRP3-/-组中小鼠LVEF和LVFS逐渐下降,于第4周时CS组小鼠心功能指标:LVEF（61.10±2.85）%和LVFS（32.44±1.31）%明显低于CS+NLRP3-/-组:LVEF（71.96±1.26）%和LVFS（41.54±0.66）%。（2）CS组小鼠心肌组织中,胶原纤维Masson染色阳性率（12.37±1.66）%明显高于CS+NLRP3-/-组（1.97±0.49）%,差异有统计学意义。（3）CS组小鼠心肌组织中NLRP3、Caspase-1p20,IL-βp17蛋白表达水平明显高于CS+NLRP3-/-组,差异有统计学意义（P＜0.05）。（4）体外细胞实验发现,CSE可诱导NLRP3、a-SMA、Collagen I和Collagen III蛋白表达水平呈浓度-时间依耐性升高,使用MCC950（NLRP3抑制剂）干预后,可显著逆转CSE诱导的a-SMA、Collagen I和Collagen III蛋白水平升高。结论:CS暴露引起小鼠心功能下降,心肌纤维化以及NLRP3、a-SMA、Collagen I和Collagen III蛋白水平升高,而NLRP3敲除可显著改善CS暴露引起的心功能下降和心肌纤维化,此外在乳鼠心脏成纤维细胞中,使用NLRP3抑制剂（MCC950）干预,可逆转CSE诱导的NLRP3、a-SMA、Collagen I和Collagen III蛋白水平升高。提示CS暴露诱导NLRP3炎性小体在心脏成纤维细胞中活化,介导心肌纤维化,进一步引起心功能下降。第四部分探究iNOS与NLRP3之间的调控机制目的:通过生物信息学分析发现iNOS与NLRP3之间存在相互作用。本部分实验主要揭示iNOS与NLRP3之间的调控机制。方法:（1）通过物理互作、基因共表达、基因共定位、基因富集分析以及网站预测等生物信息学手段在Genemania网站预测iNOS与NLRP3之间的蛋白互作关系。（2）Western blot检测小鼠心肌组织中iNOS、NLRP3、Caspase-1p20和IL-1βp17表达。随后分别使用L-NIL（iNOS抑制剂）和MCC950（NLRP3抑制剂）对乳鼠心脏成纤维细胞进行预处理1h,再给予1.5%CSE共培养48h,使用Western blot检测iNOS、NLRP3、Caspase-1p20和IL-1βp17的表达情况。（3）分别使用L-NIL（iNOS抑制剂）、TAPI-1（TACE抑制剂）、MCC950（NLRP3抑制剂）、ODQ（s GC抑制剂）以及KT5823（PKG抑制剂）对乳鼠心脏成纤维细胞进行预处理1h,再给予1.5%CSE共培养48h,使用Western blot检测iNOS、Active-TACE、NLRP3蛋白表达以及实时荧光定量PCR（q RT-PCR）检测m RNA-TNF-a的表达。结果:（1）通过生物信息学手段预测iNOS与NLRP3之间的蛋白互作关系,发现iNOS与NLRP3没有直接的互作关系,主要是通过TNF（肿瘤坏死因子）桥接发生间接的互作调控作用。（2）动物实验发现:iNOS敲除可显著逆转CS暴露导致的NLRP3、Caspase-1 p20、IL-1βp17蛋白表达升高;而NLRP3敲除不能改变CS暴露对iNOS表达的影响。体外细胞实验发现:经L-NIL（iNOS抑制剂）干预后,可显著逆转CSE诱导的iNOS、NLRP3、Caspase-1p20、IL-1βp17蛋白水平升高;而MCC950（NLRP3抑制剂）干预后,不能改变CSE对iNOS表达的影响。（3）经CSE处理后,乳鼠心肌成纤维细胞中iNOS、Active-TACE、NLRP3蛋白以及m RNA-TNF-a表达均明显上调,而经L-NIL干预后,可显著逆转CSE诱导的iNOS、ActiveTACE、NLRP3蛋白以及m RNA-TNF-a表达水平上调;经ODQ、KT5823以及TAPI-1等干预后,可显著逆转CSE诱导的ActiveTACE、NLRP3蛋白以及m RNA-TNF-a表达水平上调,但不能逆转CSE对iNOS表达的影响;经MCC950干预后,可显著逆转CSE诱导的NLRP3表达上调,但不能逆转CSE对iNOS、Active-TACE以及m RNA-TNF-a表达的影响。结论:CS诱导iNOS表达,激活sGC/cGMP/PKG/TACE/TNF-a轴,调控NLRP3炎性小体的活化,为阐明CS暴露诱导心肌纤维化提供了新的病理机制。