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第一部分:保守的RBD9.1抗原肽疫苗对突变株保护作用及机制研究背景及目的:严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）的出现及其迅速的广泛传播已引发严峻的全球突发2019年新型冠状病毒肺炎（COVID-19）疫情。而COVID-19疫苗被认为是防御SARS-CoV-2感染实现群体免疫最经济和有效的策略之一。为了尽快控制住COVID-19疫情,试剂商大大缩短COVID-19疫苗的开发周期。随着临床实验的加速,全球各国自2021年3月开始实施COVID-19疫苗广泛人群接种计划。令人担忧的是,不同国家相继初出现了广泛流行的SARS-CoV-2突变株。与SARS-CoV-2的野生型序列相比,这些SARS-CoV-2突变株的细胞受体结合区（RBD）结构域囊括了多个氨基酸的点突变,如,K417N、E484K、N501Y。研究表明,这些RBD区域的突变位点已经拮抗了目前市场上的大部分中和抗体,极大程度上削弱了现有可用疫苗的保护作用,尤其是S484和S501位点的突变。因此,研究基于RBD和血管紧张素转换酶2（ACE2）相互作用表面更为保守的B/T细胞表位的疫苗对预防SARS-CoV-2突变株感染具有重要的研究意义。本研究内容:（1）保守性SARS-CoV-2 RBD结构域B细胞表面受体和T细胞表面受体（BCR/TCR）抗原表位肽（RBD9.1）的发现;（2）RBD9.1抗原肽疫苗诱导小鼠产生中和抗体的能力评价。（3）RBD9.1抗原肽免疫原性关键氨基酸的鉴定。（4）探讨RBD9.1疫苗诱导体液免疫应答的机制。（5）RBD9.1抗原肽疫苗在体内诱导细胞免疫应答的评价。（6）RBD9.1抗原肽疫苗诱导的长效体液免疫和细胞免疫保护。（7）RBD9.1抗原肽疫苗血清诱导抗体依赖性增强作用（ADE）效应的评估。通过以上研究旨在:筛选出保守性抗原肽RBD9.1,进一步在体内探讨其诱导的体液和细胞免疫应答对突变株的保护性作用及其作用机制。方法:（1）保守性SARS-CoV-2 RBD区BCR/TCR表位抗原（RBD9.1）的发现:通过收集31例COVID-19康复者的外周血,分别分离血浆和PBMC。通过肽ELISA实验、RBD-ACE2竞争结合实验和SARS-CoV-2（野生型）毒株假病毒中和实验分别评价了RBD9.1和COVID-19康复者的结合能力和中和能力。通过比较SARS-CoV-2突变株和野生型毒株RBD9.1区域的氨基酸序列进行氨基酸保守性评估。（2）RBD9.1疫苗诱导小鼠产生中和抗体的能力评价:将RBD9.1和钥孔血蓝蛋白（KLH）偶联复合物用于Balb/c免疫小鼠,通过血清ELISA、RBD-ACE2竞争结合实验和假病毒中和实验分别评价了抗原特异性的抗体滴度和血清中和作用。（3）RBD9.1免疫原性关键氨基酸的鉴定:将长为20aa RBD9.1每个氨基酸单独突变为A并且生物素化,酶联免疫吸附实验（ELISA）检测20个RBD9.1突变肽分别和血清抗体结合的亲和性,找到RBD9.1和疫苗血清抗体关键氨基酸。（4）探讨RBD9.1疫苗诱导体液免疫应答反应的机制:流式细胞术,免疫荧光,酶联免疫斑点实验（ELISPOT）,ELISA等实验检测RBD特异性的浆细胞,生发中心B细胞和Tfh细胞的比例和数量。（5）RBD9.1疫苗诱导细胞免疫应答评价:流式细胞术和ELISA分别检测RBD9.1刺激免疫后脾细胞诱导的反应性CD69+CD8+T细胞和CD137+CD8+T细胞的比例及上清液中IL-2和IFN-γ分泌水平。（6）RBD9.1抗原肽疫苗诱导的长效体液免疫和细胞免疫保护:ELISA检测最后一次免疫后小鼠血清抗原特异性抗体的消失;竞争ELISA检测血清的中和作用;流式细胞术,ELISPOT和ELISA检测了最后一次免疫后不同天数抗原特异性的记忆B细胞的比例和频数;流式细胞术和ELISA评价RBD9.1刺激最后一次免疫后第94天脾细胞诱导的反应性CD69+CD8+T细胞和CD137+CD8+T细胞的比例及上清液中IL-2和IFN-γ分泌水平。（7）RBD9.1抗原肽疫苗血清诱导SARS-CoV-2突变株ADE效应评估:将疫苗血清和SARS-CoV-2突变株假病毒进行混合,再和表达FC受体的daudi细胞进行共孵育,通过化学发光的方法检测daudi细胞中假病毒的拷贝数。结果:（1）收集31例COVID-19康复者血清后,分别检测了RBD9.1和血清的结合力和血清的和中和能力,结果显示RBD9.1和血清的结合能力与血清的中和活性成正相关;通过序列比较,RBD9.1在SARS-CoV-2野生型和突变株中氨基酸序列保守。（2）将RBD9.1和KLH进行偶联免疫小鼠,血清能检测到RBD特异性的抗体和中和能力,并且在SARS-CoV-2（野生型）和突变株中显示出持续的中和作用。（3）通过包被生物素化后的RBD9.1突变肽,检测发现S451和S454位点是RBD9.1和血清抗体结合的关键氨基酸。（4）流式细胞术、免疫荧光、ELISPOT、ELISA等实验检测RBD特异性的浆细胞,生发中心B细胞和滤泡辅助性T细胞（Tfh）细胞的比例和数量。结果显示,RBD9.1抗原肽免疫后小鼠生发中B细胞和Tfh在体内产生和积累,从而诱导机体形成生发中心,进一步产生抗原特异性的浆细胞来分泌抗原特异性的抗体。（5）通过RBD9.1肽刺激免疫后小鼠脾细胞,流式细胞术和ELISA能够检测到P45反应性的CD69+CD8+T细胞和CD137+CD8+T细胞以及效应分子白介素-2（IL-2）和干扰素-γ（IFN-γ）的分泌。（6）RBD9.1最后一次免疫后小鼠血清抗原特异性抗体在体内持续时间可长达半年;流式细胞术、ELISPOT和ELISA检测了最后一次免疫后不同天数抗原特异性的记忆B细胞的比例和频数,发现RBD9.1诱导产生的抗原特异性的记忆B细胞能在体内持续较长的时间;流式细胞术和ELISA评价RBD9.1肽刺激最后一次免疫后第94天小鼠脾细胞,依然能检测到抗原反应性CD69+CD8+T细胞和CD137+CD8+T细胞及效应分子IL-2和IFN-γ的分泌。（7）将疫苗血清和SARS-CoV-2假病毒混合,和表达FC受体的daudi细胞进行孵育,通过生物发光的方法检测发现RBD9.1在野生型、B.1.1.7、P.1和B.1.617.2突变株中均不会诱导ADE效应。结论:通过本研究（1）发现长为20个氨基酸（aa）的RBD9.1肽段同时囊括了B细胞和T细胞表位,在Bab/c小鼠体内同时诱导B细胞和T细胞免疫应答。（2）RBD9.1在突变株中序列保守,能够诱导持续的中和作用,这为制备突变株的特异性的疫苗提供了理论依据。（3）RBD9.1免疫后能够形成长期的抗原特异性免疫记忆和保护作用,有利于RBD9.1抗原肽疫苗实现长久的保护。（4）RBD9.1能够和COVID-19康复者血清相结合,并且RBD9.1特异性的抗体含量与血清的中和能力成正比,这为RBD9.1抗原肽与临床实验数据提供了可靠且实用信息。第二部分:延长RBD疫苗加强免疫诱导机体免疫耐受的机制探究背景和目的:COVID-19疫情全球肆掠,持续进化和演变的SARS-CoV-2突变体为全球抗疫事业带来了巨大的挑战。众所周知,COVID-19疫苗能够有效的降低人群SARS-CoV-2突变株的感染率和重症率,减少患者死亡。由于病毒多样化及疫苗血清诱导的免疫力下降导致疫苗接种后出现Delta或者Omicron突变株大规模突破性感染,因此,COVID-19加强疫苗或新疫苗接种成为必要。为了尽早控制疫情,FDA已经授权对完成基础疫苗接种的成年人使用加强针疫苗。加强免疫的使用似乎是有效的,因为初步研究表明,三剂辉瑞Bio Ntech m RNA疫苗血清中和Omicron突变株的中和活性较野生型下降了大约40倍,而接种两剂疫苗的血清则几乎没有保护作用。然而,关于加强免疫的适用条件,接种频次,可能的副作用以及能否作为防御突变株感染的重要手段,这些还亟需进一步探讨。免疫耐受通常是自身抗原或者是外来抗原的反复刺激无法或者低效诱导机体产生的抗原特异性的体液免疫应答和细胞免疫应答。在HBV长期感染肝脏后,会诱导机体对HBV病毒产生适应性免疫耐受,表现为无法诱导机体产生乙肝表面抗原的特异性抗体和CD8+T细胞表面耗竭分子PD-1,CTLA-4等表达上调,使CD8+T细胞无法清除肝细胞内的乙肝病毒。抗原反复刺激可以诱导机体产生免疫耐受这是大家公认的观点,制备疫苗的过程中,为了增加抗原的免疫效果,通常会通过油包水的形式促进抗原缓慢释放。那么,在接种基础疫苗程序后多次接种COVID-19加强疫苗是倾向于诱导免疫应答还是免疫耐受呢,这些均是不清楚的。因此,深入探讨COVID-19加强疫苗诱导的体液免疫和细胞免疫应答,有助于较为全面的认识SARS-CoV-2疫苗加强免疫引起的保护性免疫应答机制,并且为全球使用同源加强疫苗来作为防御突变株的国家提供了重要的理论依据。本研究内容:（1）鉴定延长RBD疫苗加强免疫产生RBD特异性抗体能力;（2）评估延长RBD疫苗加强免疫血清的中和能力;（3）探讨延长RBD疫苗加强免疫诱导体液免疫应答的机制;（4）评估延长RBD疫苗加强免疫诱导的CD4+T细胞免疫应答;（5）评价延长RBD疫苗加强免疫诱导的CD8+T免疫应答;（6）延长RBD疫苗加强免疫诱导机体免疫耐受的鉴定。通过以上研究旨在探究延长RBD疫苗加强免疫在体内诱导的适应性免疫系统的免疫反应及其产生机制。方法:（1）鉴定延长RBD疫苗加强免疫产生RBD特异性抗体能力:根据不同的RBD疫苗免疫策略,将RBD免疫组分为常规免疫组和延长免疫组。通过血清ELISA,分别检测了血清中抗原特异性的Ig G、Ig G1和Ig G2a抗体滴度和中和作用。（2）鉴定延长RBD疫苗加强免疫免疫血清中和能力:通过RBD-ACE2竞争结合实验和假病毒中和实验分别检测了血清中抗原特异性的抗体滴度和中和作用。（3）探讨延长RBD疫苗加强免疫诱导体液免疫应答的机制:流式细胞术、免疫荧光、ELISPOT和ELISA等实验检测浆细胞、抗原特异性的记忆B细胞、生发中心B细胞和Tfh细胞的比例和数量。（4）评估延长RBD疫苗加强免疫诱导的CD4+T细胞免疫应答:流式细胞术检测RBD延长免疫组CD4+T细胞活化水平;初始T细胞（Tn）、中心记忆型T细胞（Tcm）、记忆效应型T细胞（Tem）和终末效应型T细胞（Te）亚群的比例;以及抑制性分子PD-1和LAG-3的表达。（5）评价延长RBD疫苗加强免疫诱导的CD8+T免疫应答:流式细胞术检测RBD延长免疫组CD8+T细胞活化水平;Tn、Tcm、Tem和Te亚群的比例;PD-1和LAG-3的表达。（6）延长RBD疫苗加强免疫诱导机体免疫耐受的鉴定:流式细胞术和ELISA分别检测最后一次免疫组小鼠脾脏细胞Treg的表达和血清IL-10的分泌。结果:按照Balb/c小鼠是否接种RBD蛋白疫苗加强免疫的免疫策略,将RBD免疫组分为常规免疫组和延长免疫组。（1）通过ELISA实验,发现RBD疫苗加强免疫延长组血清中抗原特异性的Ig G、Ig G1和Ig G2a抗体滴度较常规免疫组的血清降低近10倍,结果提示延长RBD疫苗加强免疫后没有产生抗原特异性的抗体。（2）RBD-h ACE2竞争结合实验以及Delta和Omicron假病毒中和实验结果显示:RBD疫苗加强针延长组和常规免疫组疫苗血清阻断RBD-h ACE2相互作用的IC50分别为34和46;RBD疫苗加强针延长组疫苗血清中和SARS-CoV-2（野生型）、Delta和Omicron突变株假病毒的IC50分别为738、399和267;常规免疫组疫苗血清中和SARS-CoV-2（野生型）、Delta和Omicron突变株假病毒的IC50分别2579、847和638,结果提示RBD疫苗加强针延长组血清的SARS-CoV-2假病毒中和活性以及RBD阻断作用较常规免疫组显著降低。（3）探讨延长RBD疫苗加强免疫诱导体液免疫应答的机制发现,RBD疫苗加强针延长组生发中心B细胞和Tfh细胞的比例和数量较常规免疫组显著降低,并且伴随生发中心活化分子PNA的低表达。结果提示延长RBD加强针能显著抑制生发中心反应形成,从而导致体液免疫应答无法充分活化产生浆细胞来分泌抗原特异性的抗体。（4）评估延长RBD疫苗加强免疫诱导的CD4+T细胞免疫应答:流式细胞术结果显示,延长RBD疫苗加强免疫组中CD4+T细胞活化水平以及CD4+T细胞记忆亚群Tcm和Tem比例较常规免疫组显著降低并且伴随着CD4+T细胞表面PD-1和LAG-3的高表达。（5）评价延长RBD疫苗加强免疫诱导的CD8+T免疫应答:ELISA和流式细胞术结果显示,延长RBD疫苗加强免疫组中CD8+T细胞活化水平以及记忆Tem亚群较常规免疫组降低,并且伴随着Te亚群细胞PD-1的高表达。（6）延长RBD疫苗加强免疫诱导免疫耐受鉴定:流式细胞术和ELISA结果显示延长RBD疫苗加强免疫组中最后一次免疫后小鼠脾脏组织Treg细胞的比例和血清IL-10的水平均增加。结论:通过本研究发现（1）延长RBD疫苗加强免疫接种可在体内抑制生发中心形成进一步无法产生抗原特异性的体液免疫应答,从而无法产生RBD特异性的抗体,诱导机体产生体液免疫耐受。（2）延长RBD疫苗加强免疫接种可抑制抗原特异性T细胞的活化并且诱导抑制性受体PD-1和LAG-3的上调,导致机体形成细胞免疫耐受。（3）延长RBD疫苗加强免疫接种促进体内Treg细胞的增殖和IL-10的分泌来形成免疫抑制性微环境,从而促进适应性免疫耐受的形成。