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采用λ噬菌体Red重组系统构建鸭大肠杆菌标准菌株073的acrB基因缺失突变株,采用荧光定量RT-PCR方法,测定并比较了O73及其不同药物诱导的5株耐药菌、acrB基因缺火突变菌株及其不同药物诱导的5株acrB基因缺失菌的主动外排基因和调控基因的mRNA的表达水平,探讨多重耐药性产生和调控的分子机制。本试验创新建立适合动物源细菌耐药基因敲除、构建耐药基因缺失株的分子生物学方法,为进一步开展多耐药基因同时缺失奠定方法学基础。利用λ噬菌体Red重组系统对鸭大肠杆菌标准菌株O73的acrB基因进行敲除。首先,基于禽大肠杆菌acrB基因的已知序列,PCR扩增获得两端带有FRT位点的卡那霉素抗性基因片段。然后,将pkD46质粒转化入O73,再把含有卡那霉素抗性基因的打靶DNA片段电转化入O73/pkD46。在Red重组系统表达重组酶的帮助下,卡那霉素抗性基因两侧的acrB基因同源序列与鸭大肠杆菌染色体上的acrB基因发生同源重组,用卡那霉素抗性平板筛选得到阳性克隆。结果表明：用短同源臂和长同源臂的Red重组技术,均得到了acrB基因敲除菌株O73ΔacrB。长同源臂的电转化效率高于长同源臂,但其打靶DNA片段的构建较为困难。采用微量稀释法测定AcrB基因敲除前、后及用5种不同药物(庆大霉素、头孢噻呋、氟苯尼考、恩诺沙星、多西环素)诱导后相应O73菌株的耐药表刑。结果表明：敲除acrB基因后的073菌株,其药物敏感性明显较原标准菌株升高。庆大霉素、头孢噻呋、氟苯尼考、恩诺沙星、多西环素的MIC,敲除前分别为：2、8、16、2和8μg/mL敲除后的分别为：1、0.06、2、0.03和05μg/mL。O73经5种药物分别诱导30代后,测得的MIC值均达到128μg/mL;而073AacrB经5种药物分别诱导30代后,测得的MIC值分别为：4、2、4、2和4μg/mL,且继续诱导,其MIC值也不能再升高。这表明：acrB基因在主动外排中的有重要作用。用荧光定量RT-PCR方法,测定了上述12株菌的5种主动外排基因acrA、acrD、tolC acrE、acrF基因和3种主动外排调控基因mar A、soxS、rob A基因的mRNA表达水平,反向研究acrB基因在鸭大肠杆菌多重耐药中的作用。对于O73的5种诱导菌株,acrA和tolC的表达量均有上升,恩诺沙星诱导尤为明显；acrF的表达量在各种药物诱导株中都有所下降；恩诺沙星诱导时,marA基因的表达量增加更为明显；5种药物诱导的菌株,soxS基因的表达量均有所下降。庆大霉素诱导时,acrD和acrE基因的mRNA表达量增加明显；多西环素诱导时,robA基因mRNA表达量增加明显。对于O73ΔacrB,acrA的表达量显著代偿性增长,三种止向调控基因的表达量也显著增加,marA的表达量增加尤为突出。这表明：在敲除acrB基因后,其主动外排调控基因相应的作用增强。O73ΔacrB其经过药物诱导后,3种外排调控基因的表达量都有所增加,而且增加幅度远远高于073的药物诱导菌株。氟苯尼考、恩诺沙星诱导的,acrD的表达量增加明显；庆大霉素诱导时,其acrE基因mRNA表达量增加较为明显。