禽白血病病毒（Avian leukosis virus,ALV）属于反转录病毒科（Retroviride），甲型反转录病毒属（Alpharetrovirus），根据病毒囊膜糖蛋白抗原性、病毒干扰试验、宿主范围及基因组分子生物学特性，将ALV划分为10个亚群，分别命名为A、B、C、D、E-I以及J亚群。其中A、B、C、D和J亚群为外源性ALV，E-I亚群为内源性ALV。ALVs可导致鸡群生产性能下降、免疫抑制和多种肿瘤表现，严重影响养禽业健康发展，因此是世界各国重点防控的病原体之一。近些年来，我国的ALV防控形势严峻，肉鸡、蛋鸡和地方鸡群中主要流行毒株多为J亚群，A/B亚群研究相对较少，然而其在鸡群中的感染率和病毒变异表现出增强趋势。为了研究福建省著名地方品系河田鸡中外源性ALV的感染状况和致病性，本研究对河田鸡群中疑似ALV感染病例进行样品采集和细胞培养进行病毒分离，通过间接免疫荧光试验、鉴定PCR对该分离株进行初步鉴定，通过分段扩增PCR进行全基因组测定及分析，从而确定该病毒的分类地位；通过接种6胚龄白来航鸡胚模拟垂直传播，并设立1日龄和42日龄同居感染组，以此阐明该毒株不同传播方式对鸡群生长性能、免疫性能、感染状态及肿瘤表型的影响。主要试验内容及结果如下：　　1.ALV-B的分离鉴定　　通过采集疑似ALV感染河田鸡的肛肠棉拭子和静脉血，通过ELISA检测肛肠棉拭子样品中的ALV群特异性抗原p27，鉴定为阳性者，对其相应的静脉血样品进行处理后接种单层DF-1细胞以分离病毒，设立空白细胞对照组。　　盲传3代后，细胞培养上清p27 ELISA检测表现为阳性的DF-1细胞进行固定，分别以p27特异性单克隆抗体（McAb）和J亚群特异性McAb作为一抗，以FITC标记的羊抗鼠IgG为二抗，进行间接免疫荧光检测（IFA），结果显示，该毒株表达p27抗原，不具备J亚群特异性gp85蛋白，为一株非J亚群的外源性ALV。提取感染细胞DNA作为模板进行gp85特异性PCR，并进行序列测定及比对分析。结果显示该毒株具有B亚群特异性gp85基因序列，并将该毒株命名为FJ15HT0。　　2.FJ15HT0的全序列测定及分析　　为进一步了解该毒株的基因组特性，根据参考ALV毒株基因序列设计8对能够覆盖ALV前病毒DNA全序列的相互重叠的引物，经分段PCR扩增出目的条带，并进行克隆和酶切鉴定，选取3个阳性克隆送至生物公司进行测序，通过软件拼接得到该分离株的前病毒DNA全基因组序列。该毒株前病毒DNA全长为7785 bp，基因组结构为5-LTR-gag-pol-env-LTR-3，符合典型的复制完全型反转录病毒的基因组结构模式，不携带原癌基因（Oncogene）。通过与各亚群经典ALV参考毒株序列进行同源性比对，发现FJ15HT0株为一株重组毒，具体分析如下：　　（1）gag和pol基因序列分析　　序列分析可知该毒株的gag与pol基因序列保守，与其他参考毒株gag基因编码的氨基酸序列同源性在96％以上，pol基因编码的氨基酸序列同源性在97%以上。　　（2）env基因序列分析　　env基因编码gp85和gp37基因，其中gp85的推导氨基酸序列与B亚群参考株同源性在91%以上，与其余亚群参考株同源性均在90%以下，其中与J亚群参考株同源性仅为48.1%；而其gp37推导氨基酸序列与E亚群参考株ev-1同源性最高为90.6%，与J亚群参考毒株HPRS103同源性最低仅为55.6%，与A、B、C、D亚群平均同源性为88.7%。　　（3）LTR序列分析及调控元件分析　　该分离株LTR序列与其他参考株的核苷酸同源性在71-90.5%之间，其中与J亚群参考株HPRS103同源性最高为90.5%；该毒株的3端U3区含有与ALV-J HPRS103相同的顺式调控元件，存在2个Y Box、2个CArG，符合复制能力强的外源性ALV的典型特征。　　（4）UTR序列分析　　该分离株5UTR与其他亚群参考株5UTR核苷酸序列同源性在83-94.5%之间，与 C亚群 Prague C毒株同源性最高为94.5%；FJ15HT0毒株的3UTR序列与参考毒株该区域序列同源性为60.3-82.4%，与A亚群参考株RSA同源性最高为82.4%。　　根据以上全序列分析，可知该毒株为具有ALV-B特异性gp85基因序列、ALV-E gp37序列、ALV-J LTR序列的重组ALV毒株。　　3.FJ15HT0分离株生物学特性　　48只SPF鸡胚随机分为4组，每组12只：A组，6胚龄接种DMEM；B组，6胚龄卵黄囊接种病毒；C组，6胚龄接种DMEM，雏鸡1日龄（d）与接毒组同居饲养；D组，6胚龄接种DMEM，42日龄时与接毒组同居饲养；各组隔离饲养直至11周龄（w）。　　（1）感染方式对排毒情况的影响　　雏鸡1d、1w、2w、3w、4w、5w、6w、7w、8w、9w、10 w、11 w时采集胎粪或泄殖腔棉拭子，采用ALV抗原检测试剂盒检测p27抗原。接毒组从1 d到11 w均可检测出p27抗原阳性，1 d同居组与42 d同居组检测p27抗原均为阴性，说明通过垂直传播途径感染能够使鸡群持续排毒，早期和晚期水平传播感染并不能使鸡群排毒。　　（2）感染方式对病毒抗体消长规律的影响　　雏鸡出壳后，分别在2w、3w、5w、7w、9w、11w采集全部鸡只抗凝血，分离血浆进行ALV-A/B抗体检测，结果显示：空白对照组均未检测到ALV-A/B抗体；接毒组从孵化到11 w均表现为ALV-A/B抗体阴性；1 d同居组在与接毒组同居饲养3 w、5 w、11 w时各出现1只鸡ALV-A/B抗体阳性，阳性率为分别为9.1%、11.1%和14.3%，在7 w时出现2只鸡检测到ALV-A/B抗体，阳性率为25%；42 d同居组在与接毒组同居饲养3周后检测到2只鸡ALV-A/B抗体阳性，阳性率为28.6%，11 w出现3只鸡检测到ALV-A/B抗体阳性，阳性率为42.9%。可见，接毒组鸡只均未检测到ALV-A/B抗体符合胚内感染导致免疫耐受的特性；同居感染鸡只最早与病毒接触后　　3周可出现血清抗体。　　（3）感染方式对病毒血症的影响　　在2w、3w、5w、7w、9w、11w采集鸡抗凝血，分离血浆，接种DF-1细胞，7 d后取上清以ELISA检测p27抗原。接毒组从1d到11w可检测到病毒血症；1d同居组在2w、3w、5w部分鸡只检测到病毒血症，42 d同居组均未检测到病毒血症，表明鸡胚接种和早期同居感染能够让鸡群产生病毒血症，而晚期同居感染未能诱发病毒血症。　　（4）感染方式对生长性能的影响　　在雏鸡1-11 w期间，每个周龄对各组鸡只进行称重，所测数据统计分析。结果显示该毒株胚内感染对白来航鸡具有显著生长抑制作用，11 w时接毒组均重仅为空白组均重的61.8%，接毒组与空白组在2-11 w差异显著（P＜0.05）；该毒株对早期同居饲养的鸡只体重具有抑制作用，11 w时1日龄同居组均重仅为空白组的67.8%，3-11 w期间1 d同居组鸡体重较空白组显著降低（P＜0.05）；该毒株对晚期同居饲养的鸡只生长性能影响不显著，42 d同居组鸡体重较空白组差异不显著（P＞0.05）；1-11 w期间接毒组鸡体重较1 d同居组差异不显著（P＜0.05）；6-11 w期间接毒组鸡体重较42 d同居组显著降低（ P＜0.05）；在2 w、3 w、4 w、6-11 w期间1 d同居组鸡体重较42 d同居组显著降低（P＜0.05）。　　（5）感染方式对免疫器官指数的影响　　在11w剖杀全部鸡只，取其胸腺、脾脏、法氏囊进行称重，计算其免疫器官指数。结果显示：接毒组脾脏、胸腺、法氏囊指数较空白组差异不显著（P＞0.05）；1 d同居组鸡的脾脏指数较空白组显著降低（P＜0.05），胸腺、法氏囊指数较空白组差异不显著（P＞0.05）；42 d同居组免疫器官指数较空白组差异均不显著（P＜0.05）。　　（6）对NDV、AIV-H5的抗体水平抑制作用　　至雏鸡7 d，全部雏鸡经点眼滴鼻的方式接种鸡新城疫LaSota株活疫苗，全部鸡只颈部皮下免疫重组禽流感病毒H5亚型二价灭活疫苗0.2 mL，在21 d同法进行二次免疫。　　在2w、3w、5w、7w、9w、11w采集鸡抗凝血，分离血浆，采用血凝抑制试验（HI）检测新城疫病毒（NDV）抗体滴度。结果显示：该毒株胚内感染对鸡只的NDV活疫苗免疫应答具有抑制作用，在3 w、9 w、11 w接毒组NDV抗体产生水平较空白组显著降低（ P＜0.05）；1 d同居组在9 w、11 w时NDV抗体产生水平较空白组差异显著降低（ P＜0.05），42 d同居组在9 w、11 w时NDV抗体产生水平较空白组差异显著降低（P＜0.05）。据此可知，该毒株对白来航鸡鸡胚接毒及同居饲养对NDV疫苗抗体的产生具有一定的抑制作用。　　雏鸡不同周龄采集抗凝血，分离血浆进行HI试验，检测抗AIV-H5灭活苗抗体滴度，结果显示：接毒组、1 d同居组、42 d同居组与空白组比较差异均不显著（P＞0.05）。　　（7）诱发肿瘤表型　　11w时剖杀所有试验动物，采集其心脏、肝脏、脾脏、肾脏、法氏囊、胸腺组织经过甲醛固定后制备石蜡切片，经过HE染色后显微镜观察其病理变化，结果显示：胚内接种FJ15HT0毒株导致感染鸡脾脏和肝脏中呈现肿瘤病灶，病灶表现为实体瘤，瘤内聚集深染的未成熟的淋巴细胞，瘤体界限较为清晰，大小不一，判定感染鸡只发生了淋巴细胞瘤。空白对照组和同居感染组试验动物组织中均未发现肿瘤存在。证实该毒株胚内感染对SPF鸡具有较强的致瘤能力。　　本研究从河田鸡中分离到一株外源性ALV，对其进行全基因组测定与序列分析，确定该毒株为一株自然重组外源性ALV。通过动物感染性试验揭示了该毒株不同感染方式对鸡群感染状态、生长性能、免疫性能和肿瘤表型的影响。本研究较为系统地揭示了FJ15HT0株的分子特性和致病特性，为了解我省河田鸡群中ALV的流行状况和遗传进化关系提供了理论依据，为地方鸡群中禽白血病的有效防制提供了重要参考。