目的和意义MicroRNA（miRNA）失调是心力衰竭心肌纤维化的重要原因。然而,miRNAs在心肌纤维化过程中的机制仍未完全清楚。本研究拟通过动物模型构建、基因芯片检测和生物信息学分析,筛选心肌纤维化过程中的关键miRNA及其调控基因,并通过体外实验探索其分子作用机制。材料和方法1.构建压力超负荷心力衰竭心肌纤维化小鼠模型、检测心肌组织基因表达采用主动脉弓缩窄术（transverse aortic constriction,TAC）构建压力超负荷心衰心肌纤维化小鼠模型。术后4周,使用心脏超声检测小鼠心脏结构和功能参数,后获取小鼠心脏组织RNA,采用基因芯片技术检测基因表达情况。2.小鼠心肌组织基因芯片数据的生物信息学分析利用小鼠心肌组织基因芯片数据,通过生物信息学方法,筛选出在小鼠纤维化心肌组织中表达水平发生显著变化的miRNA和mRNA;对差异表达基因进行基因本体论、信号通路和蛋白质相互作用分析,并筛选心肌纤维化过程中的重要蛋白相互作用模块及关键基因;利用网络数据库,对关键miRNA进行目标基因预测。3.通过实时荧光定量PCR（qPCR）验证关键基因在纤维化心肌组织中的表达情况利用前期动物实验获取的各组小鼠心肌组织,通过qPCR验证关键基因在芯片数据中的表达情况。4.通过体外细胞实验验证关键miRNA对心肌纤维化的调节作用首先,在HL-1心肌细胞中验证miRNA对目标基因的调节作用:分别采用miR-mimic、NC-mimic、miR-inhibitor、NC-inhibitor 转染 HL-1 心肌细胞,证实细胞转染成功后,qPCR检测细胞目标基因mRNA表达情况。随后,在心肌成纤维细胞中验证miRNA对心肌纤维化的影响:分别采用miR-mimic、NC-mimic、miR-inhibitor、NC-inhibitor转染大鼠心肌成纤维细胞,并以血管紧张素Ⅱ构建对应的细胞损伤模型,分别采用qPCR和Western blot检测细胞α-SMA,COL1A1,COL3A1和Ki-67的mRNA和蛋白表达,并用免疫荧光染色检测细胞α-SMA蛋白表达情况。5.统计分析采用SPSS 22.0软件进行统计分析。对于正态分布数据,采用两独立样本t检验;对于非正态分布数据,采用秩和检验,P<0.05为差异有统计学意义。结果1.各组小鼠心脏结构和心肌组织形态学变化心脏超声结果提示,TAC组小鼠的左室舒张末期内径和左室收缩末期内径明显增大（P<0.01）,射血分数显著下降（P<0.05）,观察病理切片可见,TAC组小鼠心肌组织呈现明显纤维化改变,这些结果提示,心肌纤维化小鼠模型构建成功。2.筛选小鼠纤维化心肌组织的差异表达基因提取小鼠心脏组织总RNA,通过基因芯片检测,获得13,772个基因表达数据,以Fold change>2,P<0.05为截断值,筛选出1506个差异表达基因;通过生物信息学分析,进一步筛选得到2个关键miRNA和86个重要mRNA,其中,下调的miR-338与上调的TGF-β3存在调控关系,且与心肌纤维化密切相关。3.MiR-338和TGF-β3在纤维化心肌组织中表达显著改变QPCR结果提示,在小鼠纤维化心肌组织中,miR-338表达水平明显下调（P<0.05）,TGF-β3表达水平则显著升高（P<0.05）。4.miR-338能抑制TGF-β3表达,抑制成纤维细胞增殖和胶原蛋白表达QPCR结果提示,在HL-1心肌细胞中,过表达miR-338能显著下调TGF-β3的表达水平（P<0.05）。而在心肌成纤维细胞中,过表达miR-338能显著下调α-SMA,COL1A1,COL3A1和Ki-67的表达水平,从而抑制成纤维细胞增殖和胶原蛋白表达,蛋白印迹、免疫荧光结果与qPCR结果一致（P<0.05）。结论1.MiR-338和TGF-β3在小鼠纤维化心肌组织中的表达分别显著下调和上调。2.在HL-1心肌细胞中,过表达miR-338能显著降低TGF-β3的表达水平。3.在心肌成纤维细胞中,过表达miR-338能显著抑制成纤维细胞增殖和胶原蛋白表达。