雷公藤(Tripterygium wilfordii Hook.f.)是一种重要的天然药物资源,从雷公藤植株提取分离所得到的倍半萜生物碱具有良好的医药和农用活性,经济价值大。但雷公藤次生代谢物含量低,提取分离困难,化学合成方法成本高难度大,严重制约着雷公藤植物资源的开发利用。利用代谢工程对植物代谢途径进行调控是提高次生代谢物产量的方法之一。MATE(Multidrug and Toxic compound Extrusion)蛋白是一类重要的跨膜转运蛋白,参与次生代谢物质转运等过程,因此我们对与次生代谢物转运相关的MATE转运蛋白基因进行克隆、定位与功能研究,为了解雷公藤倍半萜生物碱的跨膜转运原理、提高活性物质含量及简化后续分离操作奠定基础。目前所得研究结果如下:1.克隆了2个雷公藤MATE蛋白基因,TwMATE2开放阅读框1473 bp,编码490个氨基酸;TwMATE3开放阅读框为1518 bp,编码505个氨基酸。生物信息学分析表明TwMATE2蛋白分子量约为53.9 k Da;TwMATE3的蛋白分子质量54.5 k Da,均为不稳定疏水蛋白,二级结构中具有12个跨膜螺旋。荧光定量分析TwMATE2在雷公藤根和茎中低水平表达,叶片中表达量高;TwMATE3基因在根中大量表达,茎和叶中则低水平表达。2.构建了亚细胞定位载体p CAMBIA1302-TwMATE2,p CAMBIA1302-TwMATE3,以及红色荧光定位标记p CAMBIA1301-TIP-RFP表达载体。农杆菌转化后共注射烟草叶片进行瞬时表达,通过激光共聚焦显微镜荧光观察发现TwMATE2、TwMATE3蛋白与定位于液泡膜的TIP蛋白荧光高度重合,结果表明2个MATE蛋白均定位于烟草叶片液泡膜上。3.构建了真核表达载体p YES2/CT-TwMATE2和p YES2/CT-TwMATE3,转化到酵母细胞INVSc1中并进行半乳糖诱导表达,蛋白鉴定得到TwMATE2和TwMATE3蛋白条带,分子量分别约为53.9 k Da和54.5 k Da。底物转运实验结果证明TwMATE2、TwMATE3蛋白具有转运雷公藤次碱的功能。4.构建了p CAMBIA1301-TwMATE2,p CAMBIA1301-TwMATE3过表达载体,转化农杆菌ATCC15834后侵染雷公藤愈伤组织进行诱导,获得转基因发状根,为进一步研究雷公藤MATE基因功能奠定基础。