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甲状腺癌是内分泌系统最常见的恶性肿瘤。过去二十年,甲状腺癌新发病例在全球呈现“潮涌”态势,已成为各个国家及地区发病增长速度最快的恶性肿瘤之一。84%的甲状腺癌是乳头状甲状腺癌(Papillarythyroidcancer,PTC),对小于45岁PTC病人,淋巴结转移是预后变差的独立危险因素尚存在争议;但对于大于45岁PTC病人,学术界普遍认为这类病人的淋巴结转移与其高死亡率、手术后复发及预后差正相关。特别是与无淋巴结转移(N0)或Ⅵ区淋巴结转移(N1a)相比,发生Ⅰ-Ⅵ区淋巴结转移(N1b)的PTC病人具有更高的术后复发率。遗憾的是,目前尚未有研究报道大于45岁PTC病人淋巴结转移的分子机制。为此,本课题从两方面展开研究:第一,分析PTC-N0、PTC-N1a和PTC-N1b癌组织之间蛋白水平和分子功能的差异;第二,分析PTC-N0、PTC-N1a和PTC-N1b癌与癌旁正常组织之间蛋白水平和分子功能的差异,并深入研究潜在的调控机制,寻找新的肿瘤标志物。第一部分研究结果:通过非监督的主成分和火山图分析发现,大于45岁的PTC病人,淋巴结转移程度不同,癌组织中蛋白的表达也明显不同,而癌旁正常组织中蛋白的表达差异却很小。通过热图、信号通路和基因本体富集分析PTC-N0、PTC-N1a和PTC-N1b癌组织中的差异表达蛋白,发现这些差异表达蛋白主要富集于细胞外基质、能量代谢和细胞增殖等生物学过程,从宏观蛋白层面揭示PTC-N0、PTC-N1a和PTC-N1b预后不同的可能分子机制。第二部分研究结果:与癌旁正常组织相比,PTC-N0、PTC-N1a和PTC-N1b癌组织中蛋白的表达模式不甚相同。通过生物信息学工具筛选出PTC-N0、PTC-N1a和PTC-N1b癌组织中共同高表达的差异蛋白,并从中挑选出5个进行WesternBlotting验证,发现Versican、PL3、SERP1NA1、CD55和Asporin蛋白在PTC-N0、PTC-N1a和PTC-N1b癌组织中均高表达。免疫组化实验发现,相比癌旁正常组织,Asporin在PTC癌组织中明显高表达,且主要表达于细胞外基质、细胞膜及胞浆。TCGATHCA数据库验证发现,PTC癌组织中高表达的AsporinmRNA与大直径肿瘤,淋巴结转移,双叶占位,高TNM分期和BRAFV600E突变,总生存期和无进展生存期缩短正相关。以上结果提示Asporin在PTC中可能是个促癌基因,可促进PTC增殖、侵袭和转移。CCK8实验发现,敲低Asporin后,BCPAP和KTC-1细胞活力明显降低。克隆形成实验发现,敲低Asporin后,BCPAP和KTC-1细胞克隆形成能力明显减弱,提示Asporin具有促进PTC癌细胞增殖和克隆形成的作用。Transwell实验发现,敲低Asporin后,BCPAP、KTC-1和BHT101细胞侵袭和转移能力都明显降低,提示Asporin具有促进甲状腺癌细胞侵袭和转移的作用。为了进一步研究Asporin致病的分子机制,WesternBlotting发现,敲低BCPAP、KTC-1和BHT101细胞中Asporin后,MAPK信号通路中BRAF和p-ERK1/2蛋白表达降低,而t-ERK1/2蛋白表达不变,且MAPK信号通路下游的正向调控EMT相关蛋白β-catenin、SNAIL、SLUG、ZEB1和ZEB2表达降低。提示Asporin可通过MAPK信号通路上调其下游EMT相关蛋白的表达水平。此外,敲低Asporin后,BCPAP和KTC-1细胞形态主要呈圆形,伪足减少,胞内微丝分布紊乱,提示Asporin可通过促进MAPK信号通路的激活,上调EMT相关蛋白的表达水平,进而引起细胞骨架的改变,最后促进PTC的侵袭和转移。免疫共沉淀实验发现,Asporin可结合MAPK信号通路上游蛋白HER2,而不结合EGFR和SRC。免疫荧光实验发现,Asporin和HER2在BCPAP和KTC-1细胞膜及胞浆中共定位,进一步提示Asproin和HER2存在相互作用。通过WesternBlotting实验发现,相比对照细胞,Asporin敲低后,BCPAP和KTC-1细胞中HER2、p-HER2Y1248、p-SRCY418、p-EGFRY845和p-EGFRY1173表达水平降低,而SRC和EGFR表达水平不变,提示Asporin可通过结合HER2,上调HER2表达水平,进而使p-EGFR和p-SRC表达升高,从而激活MAPK信号通路。体外rhAsporin刺激和PLX4032抑制实验发现,rhAsporin并不能在细胞外通过结合HER2激活MAPK信号通路,且MAPK信号通路并不能够正反馈调控Asporin蛋白表达水平。总之,我们的研究首次发现Asporin/HER2/EGFR/SRC/BRAF/ERK/EMT信号轴具有促进甲状腺癌侵袭和转移的作用,未来可在动物水平进一步研究Asporin是否可成为甲状腺癌治疗的新靶点。在以上研究结果的基础上,为了研究Asporin的临床应用价值,ELISA实验发现,相比健康体检者,PTC-N0、PTC-N1a和PTC-N1b病人血清中Asporin表达升高。ROC曲线分析发现,血清Asporin区分健康体检者和PTC病人的准确为0.73;此外,血清Asporin区分淋巴结转移和淋巴结未转移PTC病人的准确为0.84。当然要实现基础到临床的转化(“Frombenchtobedside”),仍需进行大样本量和多中心的研究,进一步验证血清中Asporin是否可成为鉴别诊断健康体检者、PTC-N0、PTC-N1a、PTC-N1b病人的新肿瘤标志物。