一、研究目的及意义原发性肝癌(以下简称肝癌)是世界范围内尤其是我国常见的恶性肿瘤之一,预后差,复发和死亡率高,患者生存质量差。肿瘤的基因治疗作为一种新的治疗理念,一经出现就引起肝癌研究人员的高度重视。随着分子生物学的发展,肝癌的基因治疗尤其是自杀基因治疗为患者带来了希望,但单纯自杀基因治疗,由于目前载体转染效率较低、靶向性不够等问题没解决,仍有部分肿瘤细胞残余导致肿瘤复发,这是该疗法存在的重大缺陷。旁观者效应即转染基因的阳性细胞对未转染基因的阴性细胞的杀伤效应是自杀基因治疗的显著特点,因而增强旁观者效应目前已成为提高肿瘤自杀基因治疗疗效的重要策略。前期研究表明：体内体外实验中六味地黄丸对自杀基因系统治疗肿瘤均具有明显的增效作用,其增效作用与免疫机制和缝隙连接机制相关。六味地黄丸对肿瘤自杀基因疗法增效作用的药效物质基础是什么?其增效作用的机制如何?本实验拟通过体外实验六味地黄丸主要入血成分入手对其进行论证。并在前期研究的基础之上继续筛选对自杀基因疗法有确切增效作用的中药活性成分。通过研究以期为临床自杀基因疗法联合中药复方和单体的中西医结合治疗方案的建立提供实验数据和科学依据。二、研究方法：1.六味地黄丸主要入血成分对CBRH7919细胞株tk/GCV系统治疗的影响：按CBRH7919/tk占总细胞数10%的比例混合CBRH7919与CBRH7919/tk细胞,用适当终浓度的各入血成分单体及单体混合成分与终浓度为15.7μM的GCV分别和联合作用10%CBRH7919／tk细胞,各入血成分单体的终浓度分别为：①丹皮酚／马钱素／混合成分：25、50、100 u M；②莫诺苷／5-羟甲基-2-糠酸／獐牙菜苷：37.5、75、150μM。MTT法检测各组细胞的抑制率,用金正钧Q值分析各入血成分与自杀基因治疗系统联合作用对旁观者效应是否具有协同性。2.六味地黄丸主要入血成分混合组分淋巴细胞培养上清液的制备及对CBRH7919细胞株tk/GCV系统治疗增效作用的量效关系：SPF级健康雄性SD大鼠,消毒室剖腹取脾,制备脾淋巴细胞悬液,与药物混合组分共同培养72h,制成含药上清；不加药物混合组分培养72h,制成空白上清。按CBRH7919/tk占总细胞数10%的比例混合CBRH7919与CBRH7919/tk细胞,用7.5%、15%、30%的含药上清和空白上清与终浓度为15.7μM的GCV分别和联合作用10%CBRH7919／tk细胞,MTT法检测各组细胞的抑制率,用金正钧Q值分析含药上清和空白上清与自杀基因治疗系统联合作用对旁观者效应是否具有协同性。3.含药淋巴细胞培养上清对大鼠肝癌细胞自杀基因治疗增效作用的缝隙连接机制：设7.5%含药上清组、15%含药上清组、7.5%空白上清组、15%空白上清组,WesternBlot法检测含药上清和空白上清对CBRH7919细胞Cx43蛋白表达的影响；设置对照组、7.5%含药上清组、15%含药上清组、7.5%含药上清联合GCV组、15%含药上清联合GCV组、7.5%含药上清联合GCV+30μM甘草次酸组、7.5%含药上清联合GCV+60μM甘草次酸组、15%含药上清联合GCV+30μM甘草次酸组、15%含药上清联合GCV+60μM甘草次酸组、单独GCV组、GCV+30μM甘草次酸组、GCV+60μM甘草次酸组。GCV的终浓度为15.7μM,MTT法检测各组细胞的抑制率,观察GJIC抑制剂甘草次酸对含药上清联合tk/GCV系统对CBRH7919细胞杀伤作用的影响。4.山奈酚对CBRH7919细胞株tk/GCV系统治疗增效作用的量效关系：按CBRH7919/tk占总细胞数10%的比例混合CBRH7919与CBRH7919/tk细胞,设置对照组、15μM山奈酚组、30 u M山奈酚组、60μM山奈酚组、GCV组、15μM山奈酚联合GCV组、30μM山奈酚联合GCV组、60μM山奈酚联合GCV组,GCV的终浓度为15.7μM,MTT法检测各组细胞的抑制率,用金正钧Q值分析山奈酚与自杀基因治疗系统联合作用对旁观者效应是否具有协同性。5.山奈酚对大鼠肝癌细胞自杀基因治疗增效作用的缝隙连接机制：设对照组、15μM山奈酚组、30μM山奈酚组、60μM山奈酚组,细胞接种荧光示踪法测定山奈酚对CBRH7919细胞GJ功能的影响；RT-PCR法检测山奈酚对CBRH7919细胞Cx43mRNA的影响：Western Blot法检测山奈酚对CBRH7919细胞Cx43蛋白表达的影响。设置对照组、20μM山奈酚组、40μM山奈酚组、20μM山奈酚联合GCV组、40μM山奈酚联合GCV组、20μM山奈酚联合GCV+30μM甘草次酸组、20μM山奈酚联合GCV+60μM甘草次酸组、40μM山奈酚联合GCV+30μM甘草次酸组、40μM山奈酚联合GCV+60μM甘草次酸组、单独GCV组、GCV+30μM甘草次酸组、GCV+60μM甘草次酸组。GCV的终浓度为15.7μM,MTT法检测各组细胞的抑制率,观察GJIC抑制剂甘草次酸对山奈酚联合tk/GCV系统对CBRH7919细胞杀伤作用的影响。6.采用流式细胞技术和彗星电泳实验检测山奈酚联合CBRH7919细胞株tk/GCV系统治疗对癌细胞周期并分析其对凋亡指数的影响：按CBRH7919/tk占总细胞数10%的比例混合CBRH7919与CBRH7919/tk细胞,设置对照组、15μM山奈酚组、30μM山奈酚组、60μM山奈酚组、GCV组、15μM山奈酚联合GCV组、30μM山奈酚联合GCV组、60μM山奈酚联合GCV组, GCV的终浓度为15.7μM,流式细胞技术分析各组细胞周期相和各组细胞凋亡指数；彗星电泳实验通过观察其平均光密度值和彗星尾距以分析山奈酚联合tk/GCV系统治疗对癌细胞凋亡的影响。三、研究结果1.六味地黄丸主要入血成分对CBRH7919细胞株tk/GCV系统治疗的影响：25μM、50μM、100μM丹皮酚分别联合10%tk/GCV组的实际抑制率(17.23%、17.89%、18.46%)低于理论抑制率(19.73%、21.10%、22.75%),金正均Q值分别为0.87、0.85、0.81,均小于1.15,为相加作用；25μM、50μM、100μM马钱素分别联合10%tk/GCV组的实际抑制率为13.17%、13.86%、12.22%,理论抑制率为14.01%、12.15%、12.84%,金正均Q值分别为0.94、1.14、0.95,均小于1.15,为相加作用；75μM莫诺苷联合GCV后细胞抑制率与相应浓度莫诺苷组极为接近,37.5μM、150μM莫诺苷分别联合GCV后细胞抑制率较相应浓度莫诺苷组反而降低,不具有协同增效作用；37.5μM、75μM、150μM5-羟甲基-2-糠酸分别联合10%tk/GCV组的实际抑制率(3.00%、2.71%、1.01%)低于理论抑制率(5.45%、5.86%、2.48%),金正均Q值分别为0.55、0.46、0.41,均小于0.85,为拮抗作用；37.5μM獐牙菜苷联合GCV组的细胞抑制率为-3.22%,与空白对照组比较为细胞增殖作用,75μM、150μM獐牙菜苷联合10%tk/GCV组的实际抑制率(7.47%、2.88%)接近理论抑制率(7.25%、2.72%),金正均Q值分别为1.03、1.06,均小于1.15,为相加作用：25μM、50μM、100μM混合成分联合10%tk/GCV组的实际抑制率(4.06%、5.44%、7.37%)低于理论抑制率(14.65%、14.07%、11.13%),金正均Q值分别为0.28、0.39、0.66,均小于0.85,为拮抗作用。2.六味地黄丸主要入血成分混合组分淋巴细胞培养上清液的制备及其对CBRH7919细胞株tk/GCV系统增效作用的量效关系：7.5%、15%、30%空白上清联合10%tk/GCV组的实际抑制率(10.49%、13.16%、19.94%)低于理论抑制率(12.43%、15.33%、21.42%),金正均Q值分别为0.85、0.86、0.93,均小于1.15、大于等于0.85,为相加作用；7.5%、15%、30%含药上清联合10%tk/GCV组的实际抑制率(22.72%、26.68%、30.50%)显著高于理论抑制率(15.18%、15.27%、13.64%),金正均Q值分别为1.50、1.75、2.24,均大于1.15,具有协同增效作用。3.含药淋巴细胞培养上清对大鼠肝癌细胞自杀基因系统增效作用的缝隙连接(GJ)机制：空白上清不能提高Cx43蛋白的表达,含药上清对Cx43蛋白表达可能具有双向调节作用,高浓度的含药上清能提高Cx43蛋白的表达,低浓度则抑制其表达。7.5%含药上清联合GCV在30μM GA(甘草次酸,GJ抑制剂)阻断后细胞抑制率(27.32%)低于GA阻断前(27.83%)(P>0.05)；7.5%含药上清联合GCV在60μMGA阻断后细胞抑制率(29.56%)高于GA阻断前(27.83%)(P>0.05)；15%含药上清联合GCV在30μM和60μMGA阻断后细胞抑制率(31.40%、24.79%)与GA阻断前(34.09%)相比降低(30μMGA阻断时P>0.05；60μMGA阻断时P<0.01),提示含药上清对CBRH7919细胞GJ功能可能具有双向调节作用,高浓度时具有促进作用；含药上清对大鼠肝癌细胞自杀基因治疗系统的增效作用与缝隙连接机制有关。4.山奈酚对CBRH7919细胞株tk/GCV系统增效作用的量效关系：15μM、30μM、60μM山奈酚联合10%tk/GCV组的实际抑制率(23.44%、28.75%、53.81%)显著高于理论抑制率(15.34%、18.52%、43.58%),金正均Q值分别为1.53、1.55、1.24,均大于1.15,具有协同增效作用。5.山奈酚对大鼠肝癌细胞自杀基因治疗增效作用的缝隙连接机制：山奈酚能促进CBRH7919细胞的GJ功能,且呈量效依赖关系；山奈酚对CBRH7919细胞Cx43 mRNA和蛋白的表达具有促进作用,且具有量效依赖关系；20μM、40μM山奈酚联合GCV在30μM和60μMGA阻断后细胞抑制率(26.74%、39.55%；24.62%、32.93%)与GA阻断前(45.06%；55.11%)相比明显降低(P<0.01)。6.采用流式细胞技术和彗星电泳实验检测山奈酚联合CBRH7919细胞株tk/GCV系统治疗对癌细胞周期并分析其对凋亡指数的影响：山奈酚联合GCV后细胞周期S期阻滞率大幅提高,15、30、60μM的山奈酚联合GCV组的凋亡率(13.88%、24.06%、38.23%)明显高于15、30、60μM的山奈酚组(8.94%、13.53%、17.80%)和单独GCV组(15.44%)；彗星电泳实验显示15、30、60μM的山奈酚联合GCV后较单纯中药组和单独GCV组细胞核平均光密度值明显降低、彗星尾距显著增加。四、结论本研究初步证实从六味地黄丸的主要入血成分中分离得到的五种化合物及五种化合物的混合成分与六味地黄丸对肿瘤自杀基因疗法的增效作用无直接的药效关系,含药淋巴细胞培养上清对CBRH7919细胞HSV-tk/GCV系统治疗具有协同增效作用,其增效作用可能与缝隙连接机制有关；初步筛选出可提高CBRH7919细胞HSV-tk/GCV系统治疗旁观者效应的中药活性成分山奈酚,其增效作用可能与缝隙连接机制和细胞凋亡机制有关,进一步研究表明可能是通过提高Cx43表达、诱导凋亡、调节细胞周期而共同达到协同增效作用。