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研究背景与研究目的结直肠癌是常见的恶性肿瘤之一。近年来,随着我国人民饮食结构和生活习惯的改变,结直肠癌的发病率也逐年上升。2017年中国癌症报告数据显示,我国男性结直肠癌发病率、死亡率均位列第五,女性结直肠癌发病率位列第三,死亡率位列第五。2018年美国癌症协会统计结果显示,结直肠癌在恶性肿瘤中发病率排位第三。肿瘤发生侵袭、迁移是导致结直肠癌患者病死率居高不下的主要原因。上皮-间质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT)在肿瘤侵袭、迁移的过程中发挥了重要作用。EMT的发生可使上皮源性肿瘤细胞失去极性,降低细胞之间的粘连,破坏细胞之间的连接蛋白,获得间质细胞的相关特性,从而增加单个细胞的侵袭、迁移能力,进而促进肿瘤的侵袭和迁移。EMT的发生又涉及多个信号通路的调控,如Notch、TGF-β和Wnt/β-catenin信号通路。其中,Wnt/β-catenin信号通路在多种肿瘤中被证实与EMT的发生密切相关。Wnt/β-catenin信号通路激活后可以促进β-catenin入核与T细胞特异性转录因子/淋巴增强因子(TCF/LEF)结合,从而调节EMT的特征性因子E-cadherin的表达,进而影响EMT的发生。因此,Wnt/β-catenin信号通路的激活对于EMT的发生至关重要。研究发现,Wnt信号通路的激活在结直肠癌、胰腺癌、胃癌、乳腺癌的发生发展中起着重要的作用。SETDB1又称为组蛋白3赖氨酸9(H3K9)甲基转移酶,基因长度为50kbp,定位于人1q21染色体上,其主要功能是调节细胞相关增殖基因的活性。国内外大量研究已证实SETDB1在肝细胞癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、肾癌、脑胶质瘤、乳腺癌、黑色素瘤等多种肿瘤细胞中高表达,因此SETDB1被看作候选癌基因。本课题前期实验结果提示,SETDB1在结直肠癌组织中表达增高,并且体外实验提示沉默SETDB1基因能显著抑制结直肠癌Lovo细胞株的增殖能力,并促进其凋亡。但是,在结直肠癌中SETDB1是否也与肿瘤的侵袭、迁移能力密切相关呢?目前鲜有文献报道。因此,本研究首先利用SiRNA技术沉默SETDB1基因的表达,观察沉默SETDB1表达对结直肠癌Lovo细胞上皮-间质转化及侵袭转移能力的影响,初步探究Wnt/β-catenin通路在SETDB1诱导结直肠癌Lovo细胞上皮-间质转化中的作用。研究方法1、沉默SETDB1对结直肠癌Lovo细胞体外侵袭、迁移能力及EMT的影响(1)采用Transwell小室侵入实验观察转染组和对照组细胞体外侵袭能力的改变;(2)使用SiRNA转染Lovo细胞,采用划痕实验观察转染组和对照组细胞体外迁移能力的改变;(3)采用免疫荧光技术检测转染组和对照组F-actin细胞骨架形态的改变;(4)采用RT-PCR和Western-Blot实验分别检测转染组和对照组细胞中EMT相关标志物E-cadherin、Vimentin的mRNA和蛋白表达,分析沉默SETDB1的表达后对结直肠癌Lovo细胞EMT的影响。2、SETDB1通过调控Wnt/β-catenin信号通路诱导结直肠癌Lovo细胞发生EMT并促进其体外侵袭、迁移能力的机制的初步探究(1)抑制Wnt/β-catenin信号通路对结直肠癌Lovo细胞体外侵袭、迁移能力及EMT的影响:(1)在结直肠癌Lovo细胞中应用β-catenin特异性抑制剂XAV-939,采用Transwell小室侵入实验观察XAV-939实验组和DMSO对照组中细胞体外侵袭能力的改变,采用划痕实验观察XAV-939实验组和DMSO对照组中细胞体外迁移能力的改变;(2)采用免疫荧光技术检测实验组和对照组细胞中细胞骨架F-actin形态的改变;(3)采用RT-PCR和Western-Blot实验分别检测XAV-939实验组和DMSO对照组细胞中EMT相关标志物E-cadherin、Vimentin的mRNA和蛋白表达,分析抑制Wnt/β-catenin信号通路后对结直肠癌Lovo细胞EMT的影响;(2)利用免疫荧光技术观察沉默SETDB1后对结直肠癌Lovo细胞中β-catenin蛋白定位改变的影响;(3)通过SiRNA技术沉默SETDB1的表达后,采用Western-Blot实验检测转染组细胞核中β-catenin蛋白表达变化。结果1、沉默SETDB1对结直肠癌Lovo细胞体外侵袭、迁移能力的影响(1)Transwell小室侵入实验和划痕实验结果表明,SETDB1-SiRNA-1、SETDB1-SiRNA-2转染组细胞侵袭、迁移能力较SETDB1-SiRNA-NC阴性对照组下降,差异有统计学意义(P﹤0.05);(2)免疫荧光结果显示,在阴性对照组中F-actin浓密、规则,呈纵向纤维束排列;而SETDB1-SiRNA-1、SETDB1-SiRNA-2转染组中F-actin蛋白明显减少,纤维束样排列消失,边缘破损,呈不规则排列;(3)SETDB1-SiRNA-1、SETDB1-SiRNA-2转染组细胞中E-cadherin的mRNA和蛋白表达较SETDB1-SiRNA-NC阴性对照组的表达明显升高,而Vimentin的表达较阴性对照组明显降低(P﹤0.05)。2、SETDB1通过Wnt/β-catenin信号通路调控结直肠癌Lovo细胞诱导EMT并促进其体外侵袭、迁移能力的初步研究(1)抑制Wnt/β-catenin信号通路对结直肠癌Lovo细胞体外侵袭、迁移能力及EMT的影响:(1)Transwell小室侵入实验和划痕实验结果表明XAV-939-Lovo组细胞较DMSO-Lovo组细胞侵袭、迁移能力明显下降,差异有统计学意义(P﹤0.05);(2)免疫荧光实验结果显示,DMSO-Lovo组细胞中F-actin呈纤维束样,排列整齐,而XAV-939-Lovo组细胞中F-actin纤维稀疏,荧光减弱,排列不规则;(3)RT-PCR和Western-Blot结果显示,XAV-939-Lovo组中E-cadherin的表达上调,Vimentin的表达下调,而DMSO组中E-cadherin的表达下调,Vimentin的表达上调,差异有统计学意义(P﹤0.05);(2)免疫荧光实验结果表明,SETDB1-SiRNA-1、SETDB1-SiRNA-2转染组中β-catenin在胞核中的表达明显下调,SETDB1-Si RNA-NC组中β-catenin在胞核中的表达明显上调;(3)Western-Blot实验结果显示,SETDB1-SiRNA-1、SETDB1-SiRNA-2转染组中细胞核内β-catenin蛋白表达量呈下调趋势,而SETDB1-SiRNA-NC组中细胞核内β-catenin蛋白表达量上调。结论1、沉默SETDB1可以抑制结直肠癌Lovo细胞体外侵袭、迁移能力2、SETDB1可能是通过调节Wnt/β-catenin通路来诱导结直肠癌发生上皮-间质转化并促进其体外侵袭、迁移能力。