翅作为动物发育过程中进化出的新器官,对于动物从水生到陆生,从低空到高空的跨越具有非常重要的意义。昆虫是最先拥有翅的无脊椎动物,翅的获得是昆虫迅速成为地球上种类最多分布最广的生物类群的主要原因。家蚕是重要的经济昆虫,也是鳞翅目昆虫的重要模式。研究家蚕翅突变的形成机制,不仅可以丰富昆虫翅发育调控理论,也可为鳞翅目害虫防控提供新的理论支撑。已有研究表明,昆虫翅的发生与Hox基因的表达密切相关。翅被限定于第2和第3胸节,这是因为Hox基因的精确表达诱导翅在特定的位置发生,同时抑制了翅在其它环节的生长。如Scr抑制了第1胸节翅原基细胞的发育,Ubx和abd-A抑制了腹部区域翅的发育。Ubx基因只在后翅表达,它的作用在于调节不同的下游靶基因,从而导致前后翅形态特征的差异。Hox基因Antp在胸部表达,而在果蝇和赤拟谷盗中干涉Antp基因对翅的形态并没有影响,表明该基因并不是果蝇和赤拟谷盗翅发育所必需的。在西南大学家蚕库保存的翅突变体中,Nc、 Wes和EM都表现为纯合体胚胎致死,胸足发育异常,杂合体表现为成虫翅变小且为畸形。此前研究已表明Nc、Wes均是由于BmAntp基因突变所致,这表明BmAntp基因的异常表达能调控家蚕翅的发育,影响翅的形态。我们从这3个材料出发,研究BmAntp基因在家蚕翅发育中的表达模式特征,初步鉴定BmAntp基因在翅发育中的功能。取得的主要研究结果如下：1.突变杂合体与野生型翅的表型差异我们解剖突变杂合体和野生型不同发育时期的翅原基、蛹翅和蛾翅,对它们的表型特征进行观察比较。结果发现,突变体与野生型在上蔟前翅原基大小形态无明显差异,而上蔟后第2天随着翅原基展开,可观察到突变体翅原基无法正常伸展,出现皱缩、折叠、卷曲现象,化蛹后蛹翅残缺短小覆盖不全,成虫表现为畸形小翅。2. BmAntp在家蚕翅发育中的表达模式为了更好地了解BmAntp基因在家蚕翅发育中的功能,我们调查了BmAntp基因在家蚕前后翅中的表达模式。以野生型大造五龄1天至化蛾前后翅原基cDNA为材料,通过定量PCR检钡BmAntp基因在家蚕前后翅的表达情况。结果发现,BmAntp在大造前后翅均有表达且变化趋势基本一致,在上蔟前表达量维持在一个较低水平,而化蛹后该基因表达明显上升,一直持续到羽化前一天达到最高峰,之后表达下降。由此可以看出BmAntp在家蚕前后翅都有持续一致的表达,表达水平与翅的变态发育具有对应性,暗示对翅的发育有重要调控作用。3.突变体和野生型中BmAntp基因的结构和表达分析通过对EM突变纯合体和野生型大造胚胎cDNA进行Antp序列分析,发现EM突变纯合体中BmAntp基因Type 1转录本3’UTR区存在异常。进一步对基因3’UTR区进行RACE分析,发现在大造胚胎中扩增得到了两种新的转录本Type 2、Type 3,突变体中只扩增出一种Type 3。从五龄至羽化选取几个关键时期对Wes、Nc和EM杂合体和野生型翅原基中BmAntp的表达水平进行定量PCR分析,发现杂合体中BmAntp基因表达升高。为了进一步鉴定转录水平高表达是由BmAntp的正常还是异常转录本导致,我们通过Westernblot进行蛋白水平上的表达分析,结果显示,在突变杂合体中Antp蛋白表达降低。说明Wes、Nc和EM杂合体中翅的突变表型可能是由于BmAntp蛋白的功能缺失引起的。4. BmAntp基因对家蚕翅发育调控的机制初探我们选取了三个突变中翅突变表型最为明显的Wes突变体和野生型,在上蔟48h对翅发育通路中关键基因如ap、vg、en等进行荧光定量分析,发现在杂合体中这些基因表达量均降低。为了探究BmAntp对这些基因的调控关系,我们对这些基因上游进行转录因子结合预测分析,选取结合预测值较高的上游关键基因ap和vg,通过EMSA探究Antp蛋白与这两个基因的作用关系。结果显示,BmAntp作为转录因子,可与ap和vg直接结合,改变基因的表达,从而影响翅的发育。同时我们选取蛹5天Wes杂合体和野生型大造的前后翅分别进行芯片分析,结果显示,在Wes杂合体前翅中共筛查到24个上调表达的基因和14个下调表达的基因,后翅中有78个上调基因和30个下调基因,并对这些差异基因进行了功能注释,为后续研究奠定了重要基础。