论文部分内容阅读
那西肽(nosiheptide)是一种主要由活跃链霉菌(Streptomyces actuosus)产生且对革兰氏阳性菌有明显作用的一种含硫多肽类抗生素,是一种动力体内不残留、对环境影响小的饲料添加剂,目前工业发酵总体水平仍然较低,生产菌种的性能仍有很大的提升空间。为了提高工业发酵那西肽的生产水平,以实验室保藏的36#菌株为出发菌株,建立应用抑菌圈和微孔板培养方法筛选高产那西肽菌株的高通量筛选体系。研究结果表明突变株菌落抑菌圈径的大小,与48孔板效价及摇瓶效价之间均有比较好的相关性,抑菌圈径的大小与48孔板效价之间以及48孔板效价与摇瓶效价之间的相关系数R分别达到0.534和0.896。在装液量为0.5 mL、采用混合培养基发酵96h时,48孔板培养可以获得比较高的效价。根据对24孔板与摇瓶发酵效价相关性的验证以及与48孔板、摇瓶发酵效价的对比,利用单因素结合响应面优化法对24孔板发酵条件进行优化确定了24孔板发酵产那西肽的最佳条件：种子培养基装液量2.55 mL,发酵培养基装液量0.93 mL,发酵时间121h,在此发酵条件下效价可达到882.25ug/mL,较优化前提高30.58%,较单因素优化条件提高了10.27ug/mL。采用新型常压室温等离子体(ARTP)诱变活跃链霉菌的单孢子悬液,经过ARTP处理150s,在此条件下致死率达到98.15%。通过多轮ARTP诱变及高通量筛选最终获得了3株相对效价提高50%以上的遗传性能稳定的突变株。ARTP诱变技术是获得那西肽高产菌株的有效途径。考察了甘氨酸添加浓度、溶菌酶浓度、溶菌酶酶解时间对那西肽产生菌活跃链霉菌原生质体形成与再生的影响,得到了原生质体制备的最佳条件：：溶菌酶浓度为50mg/mL,甘氨酸的添加浓度为0.6%,酶解温度30℃,酶解时间70min。确定了ARTP对活跃链霉菌原生质体的最佳致死时间为80s,对孢子诱变筛选得到的高产突变株3-53制备原生质体进行2轮诱变筛选,得到Y2-47效价较3-53提高了15.02%。考察紫外和热处理对活跃链霉菌原生质体的致死作用,确定了热处理50min,紫外照射40min为原生质体的最佳灭活时间。选择3-53与Y2-47作为亲本进行原生质体融合,经筛选得到2株效价较Y2-47提高5%以上的菌株RH-4,RH-5,从原始出发菌株开始到最终突变株总效价共提高了70.4%。