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孢子丝菌病是由申克孢子丝菌复合体感染引起的深部真菌病,目前申克孢子丝菌复合体包含6个基因型,其中与临床密切相关的是巴西孢子丝菌、申克孢子丝菌和球形孢子丝菌。球形孢子丝菌在全球广泛分布,孢子丝菌病在我国东北地区高发,且目前东北地区报告的孢子丝菌病均由球形孢子丝菌引起。与巴西孢子丝菌易引起播散感染不同,球形孢子丝菌感染人体后以固定型多见,可能与该菌相对较低的致病性有关,因此该菌感染人体后诱导的免疫反应可能不同于其他菌种。但是大量报道表明当机体存在免疫抑制的因素时,如器官移植、HIV等,球形孢子丝菌亦可播散至内脏,威胁生命。至今,关于人体抗孢子丝菌免疫机制的研究较少。现有研究多以小鼠模型和体外研究为主。研究表明抗孢子丝菌免疫反应主要以Th1和Th17细胞免疫为主。此外,在人体和小鼠模型中均检测到针对申克孢子丝菌和巴西孢子丝菌的特异性抗体成分,如抗Gp70蛋白抗体,提示体液免疫也参与其中。然而B细胞和Tfh细胞作为体液免疫的重要成分在孢子丝菌病中的研究十分有限。为了探索人体感染球形孢子丝菌后细胞免疫和体液免疫的变化,以及与该病临床类型和病程之间的关联,我们先后纳入84例成人孢子丝菌病患者,进行了外周、皮损局部和体外共培养三部分的实验研究。第一部分我们收集了50名成年孢子丝菌病患者外周血,采用性别组成和平均年龄均与实验组匹配的25名健康人作为对照。用流式细胞术的方法,通过检测外周血单个核细胞中CD4+T细胞亚群各自表达的特异性转录因子,分析外周血中CD4+T-bet+Th1、CD4+GATA-3+Th2和CD4+ROR-γt+Th17细胞的比例。结果显示全部患者外周血Th2比例显著高于健康对照组（P=0.0119）,病程小于6个月（P=0.0413）和大于6个月（P=0.0226）患者外周血Th2均显著增高;而Th1和Th17比例变化不显著。固定型和淋巴管型患者与健康对照比较,仅Th2在固定型患者中显著升高（P=0.0058）。我们进一步通过分析CD4+T细胞内表达的特异性细胞因子情况来验证上述Th1、Th17和Th2比例改变情况。我们继续收集了18个孢子丝菌病患者以及20个年龄性别匹配的健康人的外周血进行流式分析。结果显示,与健康对照比较CD4+IFN-γ+Th1比例在总体患者中未见显著升高,但在小于6个月患者中Th1显著升高（P=0.0006）;CD4+IL-4+Th2和CD4+IL-17A+Th17在总体患者以及不同病程患者中占比均较健康对照显著升高（Th2:病程小于6个月（P<0.0001）;病程>6个月（P=0.0018）;Th17:病程<6个月（P<0.0001）;病程>6个月（P<0.0001））;无论总体患者或是不同病程的患者Th1/Th2均显著低于健康对照（全部患者（P=0.0011）;病程<6个月（P=0.0349）;病程>6个月（P=0.0106））。通过分析CD4+CD25+CD127-Treg细胞,我们进一步将效应T细胞/Tregs（Teff/Tregs）比值进行组间比较,来评估机体促炎免疫和抑炎免疫的倾向性。发现各组中Th2/Tregs比值较健康对照均显著升高（全部患者（P=0.0014）;小于6个月（P=0.0059）;大于6个月（P=0.0067）;固定型（P=0.0016）;淋巴管型（P=0.0383））。Th17/Tregs在全部孢子丝菌病患者中升高（P=0.0425）,其中固定型患者Th17/Tregs较健康对照升高显著（P=0.016）,淋巴管型和不同病程患者的Th17/Tregs与健康对照相比无显著差异。Th1/Tregs未见显著改变。以上提示球形孢子丝菌感染患者外周血呈现Th2免疫反应倾向,而Th17和Th1反应相对较弱,且对病程长短影响不大。此外,为了研究患者外周血中体液免疫状态,我们分析了CD4+CXCR5+PD1+Tfh细胞和CD19+B细胞及其亚型（Ig D+CD27-幼稚B细胞（NB）,Ig D+CD27+记忆性未转化B细胞（USM）,Ig D-CD27+记忆性转化B细胞（SM）,和Ig D-CD27-双阴性B细胞（DN））。发现虽然Tfh以及CD19+B细胞比例均没有显著改变,但总体患者的USM B细胞比例显著下降（P=0.0354）,而SM B细胞和DN B细胞比例显著升高（SM B（P=0.0349）,DN B（P=0.0002））。同时发现,病程小于6个月患者与总体患者B细胞的变化趋势一致（USM B（P=0.0335）,SM B（P=0.0076）,DN B（P=0.0086））;而病程大于6个月或不同临床类型的患者中仅DN B细胞比例显著升高（病程>6个月（P=0.0018）,固定型（P=0.0071）,淋巴管型（P=0.0013））。提示USM B和SM B主要在感染早期参与机体免疫反应。此外,通过相关性分析发现DN B细胞与Th2和Treg细胞显著正相关（P=0.01,P=0.04）。以上结果提示球形孢子丝菌主要在感染早期诱导机体产生B细胞介导的免疫反应（体液免疫）,其中的DN B亚群与T细胞免疫之间存在相互作用。为了进一步评估孢子丝菌病患者体液免疫状态,我们采用ELISA方法进一步检测了患者血清中Teff特异性细胞因子（IL-4、IL-17A、IFN-γ）和抑制性细胞因子TGF-β1的水平,以及抗体Ig G（包括Ig G亚群Ig G1、Ig G2、Ig G3和Ig G4）、Ig M和Ig E水平。结果显示,与正常对照相比,总体患者血清中IFN-γ和IL-4显著升高（P=0.04,P=0.008）,IL-17A和TGF-β1显著降低（P=0.001,P=0.001）;固定型患者血清中IL-4升高（P=0.0089）伴随IL-17A降低（P=0.0012）而淋巴管型患者血清中IFN-γ升高（P=0.0355）;不同病程患者与健康对照比较显示TGF-β1降低,IFN-γ、IL-4和IL-17A均无显著改变。以上提示固定型和淋巴管型细胞因子的表达情况存在差异,但对病程长短影响不大。免疫球蛋白Ig G、Ig M和Ig E均未见显著改变,仅Ig G2和Ig G4在小于6个月患者中降低。为了探究皮损局部的免疫改变,我们采用免疫组化方法检测了局部IFN-γ、IL-4和IL-17A的表达情况。我们选取16个真菌培养阳性的孢子丝菌病患者皮损组织,采用正常人健康皮肤作为阴性对照、手术获取的淋巴结作为阳性对照,利用免疫组化的方法检测皮损内IFN-γ、IL-4和IL-17A表达情况。结果显示皮损局部IFN-γ、IL-4和IL-17A均有表达,但IFN-γ和IL-4阳性率（10/15和9/15）明显高于IL-17A（4/15）。健康人皮肤组织内IFN-γ、IL-4和IL-17A完全不表达。可见在皮损局部仍存在Th2反应,同时伴显著的Th1反应,与外周血中IFN-γ、IL-4水平升高情况符合。固定型比淋巴管皮损内表达更多的IFN-γ和IL-4,这说明皮损局部的细胞因子可能影响孢子丝菌病的临床表现及分型。第三部分为球形孢子丝菌与健康人PBMCs的体外共培养实验。首先分离健康人外周血PBMCs,与活的球形孢子丝菌酵母细胞以不同的比例共培养,然后流式细胞术检测CD4+IFN-γ+Th1、CD4+IL-4+Th2和CD4+IL-17A+Th17细胞分化情况。与不加菌的对照组比较,结果显示除了酵母细胞:PBMCs为10:1组,酵母细胞:PBMCs为1:1/2.5:1/5:1时Teff细胞各个亚群比例均显著增加,与人体内（外周血和皮损局部）变化不一致,体外条件下球形孢子丝菌刺激下的Teff细胞各亚群的分化不具有倾向性。本研究第一次发现球形孢子丝菌病患者体内Th2倾向的免疫改变,B细胞亚群的改变及DN B细胞与Th2和Treg的关联性。这说明作为毒力相对较弱的球形孢子丝菌诱导人体产生的免疫反应不同于申克孢子丝菌和巴西孢子丝菌。此外,固定型和淋巴管型患者外周血以及皮损处分泌的细胞因子存在显著不同,说明球形孢子丝菌感染患者的临床表现受到局部或外周血细胞因子水平的影响。以上研究成果为今后寻找降低Th2反应,增强Th1、Th17反应的治疗手段提供理论依据。