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结核病(Tuberculosis,TB)是一种由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)引起的呼吸道慢性传染病,迄今为止已导致数亿人死亡,对人类的健康造成了严重威胁。MTB具有生长缓慢,专性需氧,含有大量脂质,易发生耐药性等特点。此外,MTB具有特殊的细胞壁结构,该细胞壁结构与细菌感染、增值、致病性、免疫逃逸等特征密切相关。MTB细胞壁基本结构组成为:分枝菌酸(mycolic acid)、聚阿拉伯半乳糖(arabinogalactan,AG)和肽聚糖(peptidoglycan,PGN)。其中PGN具有特殊的大分子网状结构,由β-1,4糖苷键将N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡糖胺交替接连而形成,该稳定的共价网络结构使MTB在多种严苛的条件下,仍能有效躲避宿主的免疫监控和清除系统。据文献报道,Rv1096是结核分枝杆菌预测的肽聚糖脱乙酰化酶,但是其免疫学功能尚未可知,因而在本研究中我们对Rv1096在结核分枝杆菌致病过程中的功能进行了探究。在本文中,我们扩增出结核分枝杆菌H37Rv Rv1096的基因序列,经双酶切后连接到穿梭载体p MV261上,测序确定序列正确后,将质粒电转耻垢分枝杆菌菌株mc2155中,成功构建过表达Rv1096的耻垢分枝杆菌(MS_Rv1096)。通过MS_Vec和MS_Rv1096感染RAW264.7小鼠巨噬细胞和小鼠骨髓来源巨噬细胞(Bone marrow derived macrophage,BMDM),统计MS_Rv1096在巨噬细胞中存活的情况。CFU结果表明,MS_Rv1096在巨噬细胞内存活率明显高于对照组。同时,我们检测了MS_Rv1096感染巨噬细胞后细胞因子以及炎症信号通路的变化,发现过表达Rv1096后能够抑制巨噬细胞TNF-α、IL-6、IL-1β的产生,并且抑制了相关炎症信号通路分子的表达。此外,通过腹腔注射和滴鼻两种方式,以MS_Vec和MS_Rv1096分别感染小鼠,观察肺、肝、脾组织中的细菌载量,以及血液和肺部的炎症因子含量。体内模型结果表明,MS_Rv1096感染组肺、肝、脾组织中的细菌载量高于对照组,肺部炎症浸润减少,血液和肺部炎症因子含量降低。文献报道,李斯特菌肽聚糖脱乙酰化后能够帮助菌体逃避溶菌酶杀伤,为了验证Rv1096是否在MTB感染过程中起肽聚糖脱乙酰化酶作用,帮助逃避溶菌酶杀伤,我们在含有不同浓度溶菌酶的培养基中培养MS_Vec和MS_Rv1096,观察两组菌的生长密度和速度,检测了Rv1096过表达的耻垢分枝杆菌对溶菌酶耐受能力的强弱。实验结果表明:过表达Rv1096的耻垢分枝杆菌MS_Rv1096对溶菌酶表现出更强的耐受能力,并且具有高度的浓度依赖性。为进一步研究Rv1096的抑炎功能与酶活性的关系,我们利用傅里叶红外光谱法证明了Rv1096的脱乙酰化酶功能;在溶菌酶耐受试验中证实Rv1096能够帮助分枝杆菌逃避一定浓度溶菌酶的杀伤;此外据文献报道,TLR2可以识别肽聚糖,MS_Rv1096感染TLR2-/-和My D88-/-小鼠BMDM细胞后发现Rv1096的抑炎作用依赖于TLR2信号通路。综上可知:Rv1096对肽聚糖脱乙酰化后,MTB可有效躲避宿主溶菌酶的杀伤,促进结核分枝杆菌在胞内存活,同时Rv1096对炎症反应的抑制作用可能是由于脱乙酰化后的肽聚糖被TLR2受体识别减少,导致下游炎症信号通路激活也相应减少。