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第一部分:脂质沉积对肾小管葡萄糖重吸收关键分子表达的影响背景:肾脏通过其近端肾小管重吸收葡萄糖维持全身血糖稳态。研究证实内脏脂质沉积是多种代谢紊乱的重要驱动因素。本课题组前期实验发现大鼠肾脏脂质蓄积会通过上调SGLT2分子增加葡萄糖的重吸收,而其他肾小管葡萄糖重吸收分子并未进一步探讨。因此,本研究旨在通过动物实验和细胞实验进一步研究探讨脂质沉积与SGLT1、GLUT1、GLUT2和ATPα1分子m RNA和蛋白表达之间的相关性。方法:6周龄的C57BL/6雄性小鼠分到随机两组,一组喂养正常的饲料（control,CON）,另一组喂养高脂的饲料（high fat diet,HFD）,继续饲养12周建立肥胖小鼠模型,HFD组小鼠的体重高于CON组小鼠体重的20%可认为成功造模。两组小鼠予以腹腔葡萄糖耐量实验（intraperitoneal glucose tolerance test,IPGTT）及腹腔胰岛素耐量实验（intraperitoneal insulin tolerance test,IPITT）。血糖测量同时,代谢笼留取小鼠24小时的尿液,测量尿糖含量。采取血样本,测定血脂、肌酐、尿素氮等生化指标。取肾皮质组织,采用油红O染色和游离脂肪酸（FFA）定量测定法测定其脂质含量。采用免疫荧光实验、蛋白印迹实验（western blot,WB）和荧光定量实时聚合酶链反应（q PCR）检测肾脏葡萄糖转运蛋白的表达水平。体外部分,用棕榈酸（PA）处理HK2细胞。检测细胞内脂滴沉积、葡萄糖摄取活力,及葡萄糖重吸收关键分子的表达情况。结果:1.HFD组小鼠体重比之CON组小鼠增高明显（P<0.0001）,连续12周监测两组小鼠血糖,两组小鼠平均血糖并未发现明显差异（P=0.056）。2.IPGTT与IPITT结果提示HFD组小鼠已经出现糖耐量受损,但是未达到糖尿病诊断标准。3.油红O结果表明,HFD组小鼠肾小管内明显脂质沉积,而CON组小鼠肾脏中未见明显脂滴沉积;肾皮质游离脂肪酸定量检测结果发现HFD小鼠肾皮质游离脂肪酸水平明显强于CON组小鼠（P<0.0001）。4.免疫荧光实验、q PCR及WB结果显示HFD组小鼠GLUT1、SGLT2和ATPα1分子的表达水平明显高于CON组。然而SGLT1和GLUT2分子表达在两组间未见明显差异。5.Pearson相关性分析结果表明肾皮质游离脂肪酸水平与GLUT1、SGLT2和ATPα1分子m RNA和蛋白表达水平呈现正相关。6.体外实验也证实,PA干预后HK2细胞内脂滴显著沉积,且其葡萄糖摄取活力增强明显,同时PA干预HK2细胞后SGLT2、GLUT1和ATPα1蛋白的表达显著上调。结论:我们的研究结果发现,肾脏脂质沉积虽然并未改变GLUT2和SGLT1分子的表达水平,但是其上调了肾小管上皮中SGLT2、GLUT1和ATPα1分子的表达,从而导致肾脏葡萄糖重吸收增加,为脂代谢紊乱参与糖尿病的发生发展提供了新方向。第二部分:PPAR-α调控脂代谢影响肾小管葡萄糖转运蛋白背景:肥胖患者体内的游离脂肪酸（Free fatty acid,FFA）含量通常会升高。棕榈酸（palmitic acid,PA）是循环中含量最丰富的饱和FFA,摄入大量的饱和脂肪酸（尤其是PA）会增加血液中游离脂肪酸的浓度从而导致炎症反应。第一部分的动物研究和细胞研究结果表明肾脏脂质沉积是引起肾小管葡萄糖转运蛋白表达上调的重要因素,然而改善脂质沉积是否可以逆转葡萄糖转运蛋白的上调值得进一步探究。PPAR-α属于配体激活的核激素受体转录因子,表达在肾脏的近端小管中,可检测到细胞质中的游离脂肪酸及其衍生物,并将其转移到细胞核中,调节脂肪酸氧化基因的表达。至此,综合前一部分的研究结果,我们拟从体外使用PPAR-α激动剂非诺贝特逆转脂质沉积后观察SGLT2和GLUT1蛋白的改变情况。方法:检测采用免疫荧光染色和WB实验检测PPAR-α蛋白在CON组及HFD组小鼠中的表达情况。将人近端小管上皮细胞（HK2细胞）分为正常对照组和PA干预组,使用免疫荧光染色和WB实验检测两组HK2细胞的PPAR-α表达水平变化。此外,HK2细胞给予PA和非诺贝特共同处理后,再次评估胞内脂质沉积情况,免疫荧光检测GLUT1、SGLT2和PPAR-α表达水平。结果:1.两组小鼠的免疫荧光染色结果发现正常小鼠近端肾小管中表达PPAR-α分子,HFD组小鼠PPAR-α分子的平均荧光强度低于CON组,WB实验结果与免疫荧光结果一致。Pearson相关分析显示PPAR-α分子与FFA呈负相关,与GLUT1和SGLT2亦呈负相关。2.200μmol/LPA干预HK2细胞后WB结果发现PA处理组的PPAR-α分子在蛋白水平表达下降显著（P<0.05）,免疫荧光染色结果发现正常HK2细胞表达PPAR-α分子,而且PA处理组的HK2细胞的荧光强度较正常对照组相比明显减弱。3.同时给与PA和非诺贝特干预后,可见细胞内脂质沉积明显改善,免疫荧光染色结果发现PPAR-α蛋白表达上调且SGLT2和GLUT1表达较单独PA处理组显著减弱。结论:PPAR-α激动剂非诺贝特可逆转PPAR-α分子下调引起的细胞脂质沉积和表达上调的SGLT2和GLUT1分子。