蛇足石杉(Huperzia serrata(Thunb.)Trev.)又名千层塔,一种传统的中草药,其所含生物碱石杉碱甲(HuperzineA)对治疗老年痴呆有很好效果,但蛇足石杉对生长环境要求较高,生长周期长,其长成成株需要6-15年,其野生资源比较匮乏。因此,不少科学家试图通过化学合成HupA、组织培养蛇足石杉等方法来缓解HupA的市场需求,但是其化学合成工艺复杂且活性远不如天然产物,而且由于蛇足石杉生长环境及自身繁殖等特性使得组织培养技术也尚未成熟。目前,蛇足石杉野生资源是获得HupA的主要来源。本试验主要从两个方面对蛇足石杉进行研究。一方面,通过对蛇足石杉进行转录组测序寻找HupA代谢合成相关通路,挖掘与HupA代谢合成相关的功能基因。另一方面,通过SSR标记技术分析蛇足石杉野生资源遗传多样性及群体遗传结构,探究蛇足石杉进化演变,为其合理保护、利用、开发策略的提出提供理论依据。研究结果如下:(1)构建了蛇足石杉cDNA文库。经转录组测序及组装获得蛇足石杉unigene和contig分别为111,251和228,035条。通过功能注释共有48989条unigenes获得注释信息,其中在Nr库中有47629(43.9%)条unigenes获得同源信息;有29362(59.9%)unigeges注释到GO数据库;在KOG数据库获得注释的unigene有25061(51.2%)个;注释到 KEGG、Pfam、COG、Swissport 数据库中的 unigene 分别为 16948(34.6%)、28754(58.7%)、16782(34.3%)和 21507(43.9%)个。此外,在 KEGG 代谢通路中寻找到与HupA代谢合成相关的通路,即赖氨酸合成途径(lysine biosynthesis)和赖氨酸降解途径(lysine degradation)。其中,在赖氨酸降解途径中,涉及L-赖氨酸合成有两条途径,即赖氨酸合成途径(lysine biosythesis)和生物素代谢途径(Biotin metabolism)。(2)通过功能注释获得许多可能直接或者间接参与蛇足石杉体内生物碱代谢合成相关的功能基因。在涉及到的这些unigenes中,已报到的参与HupA合成的unigene有8条;涉及托品烷(tropane)、哌啶(piperidine)、吡啶(pyridine)生物碱合成的相关酶的unigene有31条;涉及编码参与赖氨酸代谢相关的酶的unigene有2条。(3)利用MISA软件对1kb以上的unigene做SSR分析,在评估的14913条序列中共识别到SSR位点4395个。随机挑选并合成了 120对引物并对蛇足石杉样品进行PCR扩增,最终获得了 10对扩增效果较好的SSR引物,通过毛细管电泳检测到引物等位位点数均值为7.2,各引物均具有多态性。(4)分析蛇足石杉遗传多样性,其期望杂合度(He)值范围:0.503(陕西汉中SQ)-0.652(云南金平YJ);shannon信息指数(I)其范围为0.845(陕西汉中SQ)-1.118(云南金平YJ),Nei基因多样性范围为0.495(陕西汉中SQ)-0.641(云南金平YJ)。分析结果表明蛇足石杉样品其遗传多样性明显高于其他濒危物种,本试验中蛇足石杉遗传多样性比较丰富,其适应外界环境的能力较强,因此,目前其野生资源稀少的主要原因不是自然选择的结果,可能是人类的干扰及不合理开采所导致的。通过HPLC测定五个地区蛇足石杉中HupA及HupB的含量,其中来自云南金平(YJ)的蛇足石杉中HupA的含量高于其他四个地区,为0.1609±0.0029,HupB含量则没有较大差异。此外,云南金平蛇足石杉遗传多样也最高(He = 0.652;I = 1.118;Nei = 0.641),因此,来自云南金平的蛇足石杉资源对于其遗传多样性的保护后续蛇足石杉资源的利用有着更为深远的意义。(5)STRUCTURE软件分析蛇足石杉遗传结构结果表明,K = 3时为最优模型,来自五个地区的蛇足石杉样品分为三个次级亚群。在这三个次级亚群中,每个亚群都含有来自五个地区的蛇足石杉,这说明蛇足石杉野生资源群体间遗传相似性较高。通过NJ法对177个蛇足石杉个体聚类分析进一步观察蛇足石杉居群间关系,五个地区的蛇足石杉聚为三类,与STRUCTURE分析结果一致。此外,ANOVA分析得出蛇足石杉群体内的分化程度为88.21%,群体间的分化为11.79%,P值均小于0.001,说明蛇足石杉遗传变异主要分布于居群内。(6)蛇足石杉居群间遗传分化系数Fst为0.1093,本研究中有8个位点偏离了Hardy-Wein berg平衡,表现为杂合子过剩,这说明蛇足石杉野生资源存在较少近交现象,而且蛇足石杉野生资源存在着较高水平的基因流(Nm = 2.0379)。较高的基因流增加了蛇足石杉野生资源遗传多样性,同时降低了居群间的遗传分化,使得蛇足石杉野生资源具有较强的适应性。其次,通过对五个地区蛇足石杉遗传分化及居群遗传结构分析表明,繁殖方式是影响蛇足石杉遗传分化的主要因素,有性繁殖(孢子繁殖)为蛇足石杉的主要方式,孢子粉通过风媒等介质进行传播。