目的:假性软骨发育不全(PSACH)是一种罕见的常染色体显性遗传病,患病率约为1/30000,与软骨寡聚基质蛋白(COMP)基因突变相关,其特征是短肢型侏儒、鸭步态和早发性骨关节炎等。患者通常在出生时身高和体重无异常,在18-24个月左右出现生长迟缓,成年个体身高通常在82-130厘米之间。临床中,针对PSACH尚无有效的干预手段。COMP基因位于19号染色体,编码COMP蛋白。COMP蛋白是一种细胞外基质糖蛋白,是血小板反应蛋白家族成员之一。COMP蛋白,由5个亚单位组成,每个亚单位有一个N端结构域、四个表皮生长因子区、七个T3重复区和一个羟基末端球状区(CTD)。T3重复区和CTD区富含钙离子结合位点,在蛋白质折叠中起主导作用。在已经发现的200多个导致PSACH的突变中,85%位于T3重复区,15%位于CTD区。电镜研究发现,T3区域突变引起的PSACH患者软骨细胞粗面内质网(ER)中积聚了大量突变的COMP蛋白和其他细胞外基质蛋白,进而引起内质网应激,导致软骨细胞过早凋亡,引发软骨内骨形成受损。目前,CTD区域突变引起的PSACH的发病机制尚无明确定论,有待进一步探索。本研究拟基于高通量测序(NGS)和单核苷酸多态性(SNP)连锁分析技术设计、优化并实施一项针对PSACH的胚胎植入前遗传学检测方案(PGT),避免高遗传风险患儿的出生;同时建立PSACH特异性诱导多能干细胞系(iPS)和经血源间充质干细胞系(MenSCs),克服人源标本来源不足和模式动物的物种限制;利用干细胞模型通过体外和计算机模拟的方法来探究致病性c.1675G>A(p.E559K)变异对COMP蛋白结构和功能的影响,探讨PSACH疾病相关致病分子机制,为疾病的治疗奠定基础。方法:收集于中国医科大学附属盛京医院生殖医学中心就诊的PSACH患者家系临床信息和样本,明确家系携带的基因变异位点,利用文献数据库检索和生物信息学预测软件对变异位点进行致病性评价,并依据美国医学遗传学和基因组学学会(ACMG)发布的针对序列变异的解读标准和指南进行变异位点的有害性分类,明确变异致病性。患者于月经第3天,采用拮抗剂方案促排卵,取卵后行卵胞浆内单精子显微注射,受精卵培养至囊胚期,进行滋养层细胞活检。应用NGS联合SNP连锁分析技术进行PGT检测,筛选出正常囊胚进行冷冻囊胚解冻移植。取患者和正常人月经第2-3天废弃月经血,分离培养MenSCs,传代扩增并鉴定。采用慢病毒法诱导MenSCs重编程,获得PSACH疾病特异性iPS细胞系。通过免疫荧光检测多能性标记物OCT4、SOX2、Nanog,实时荧光定量PCR检测内源多能性基因和外源重编程基因相对表达量,体外分化拟胚体实验鉴定i PS细胞多能性,并对细胞系COMP基因测序验证变异位点。利用体外定向分化技术诱导正常对照组和PSACH组MenSCs成软骨分化,分别于第0天、7天、14天收集软骨细胞提取RNA反转录扩增,实时荧光定量PCR检测COMP、SOX9、COL2A1、COL1A2、COL1A1、ACAN等软骨标记物的转录水平。取两组成软骨分化第21天的软骨小球进行甲苯胺蓝染色,计算并比较染色阳性率,采用TUNEL法检测软骨细胞的凋亡水平。同时采用电镜观察体外诱导的软骨细胞超纤维结构,利用实时荧光定量PCR检测内质网应激特异性标记的表达情况。从蛋白质结构数据库获取野生型COMP蛋白的结构模型,利用点突变建立c.1675G>A(p.E559K)蛋白的三维模型,并评估结构模型的合理性。采用GROMACS进行分子动力学模拟,获取轨迹文件,计算分析均方根偏差(RMSD)、均方根涨落(RMSFs)、回旋半径(Rg)、溶剂可及表面积(SASA)和二级结构,并采用Xmgrace和R软件绘图。本研究所有研究内容均经中国医科大学伦理委员会批准,患者按要求签署知情同意书后执行。结果:通过对该家系进行遗传学分析后,发现该家系患病者均携带COMP基因c.1675G>A(p.E559K)杂合变异,家系内正常个体不携带该变异。依据ACMG遗传变异分类联合标准规则评估c.1675G>A变异为可能致病性的基因变异。结合患者临床表现,经权威遗传学专家评估后,明确c.1675G>A(p.E559K)变异为该家系致病变异位点。患者促排后获卵9枚,受精9枚,囊胚培养4枚,PGT结果提示,1枚胚胎符合移植标准,行冷冻囊胚解冻移植,成功妊娠,于妊娠中期进行羊水穿刺检查,测序结果提示胎儿未携带该变异位点。患者已于2019年6月顺利分娩一健康男婴,目前生长发育良好。从患者及正常人月经血分离培养获得的MenSCs表达CD44、CD73和CD105,不表达CD34、CD38和CD45,且可诱导分化成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞,符合间充质干细胞特性。采用慢病毒感染诱导MenSCs重编程,获得胚胎干细胞样细胞表达多能干细胞特异性表面标记OCT4、SOX2、Nanog,实时荧光定量PCR提示该细胞不表达外源性重编程因子,表达内源性多能干细胞标记基因。体外分化实验证实该细胞系可向三胚层组织结构分化。DNA测序验证该细胞系携带COMP基因c.1675G>A杂合变异,可用于进一步实验研究。体外定向诱导患者和健康人MenSCs成软骨分化,两种细胞系均可诱导形成白色软骨球,但PSACH源软骨球较小且形态不规则,表面粗糙。PSACH源干细胞诱导成软骨细胞形成率降低,成软骨过程中软骨相关表面标记COMP、SOX9、COL2A1、ACAN表达减低,COL1A2、COL1A1表达增高,提示软骨形成受限。诱导成软骨21天,TUNEL检测发现PSACH组细胞凋亡率增高,电镜观察超纤维微结构发现PSACH组细胞中粗面内质网轻度扩张,实时荧光定量PCR提示PSACH组ATF6、caspase-3、CHOP表达水平升高,抗凋亡蛋白bcl-2表达降低,提示PSACH干细胞来源的软骨细胞与野生型相比内质网应激相关通路表达增强,凋亡增加。分子动力学模拟显示,在约125纳秒内,野生型和c.1675G>A(p.E559K)体系均达到平衡并形成稳定构象,但c.1675G>A(p.E559K)系统中可观察到更大的RMSD和较高的平均Rg和SASA值。并且RMSF分析显示,c.1675G>A(p.E559K)体系位于T3重复序列的375至425位残基的波动性增加,推测c.1675G>A(p.E559K)体系的稳定性更差,可能影响蛋白与钙离子等的相互作用,影响蛋白质的正确折叠,诱发内质网应激,促使细胞凋亡。结论:PGT是可供假性软骨发育不全患者家庭选择的一种重要的优生方式,可阻断疾病致病变异向子代的传递,有效避免高遗传风险患儿出生,减轻家庭和社会负担;成功构建携带致病性c.1675G>A(p.E559K)杂合变异的PSACH疾病特异性MenSCs和iPS细胞系,为PSACH的发生机制的深入研究及药物筛选提供坚实基础。PSACH干细胞来源的软骨细胞再现了PSACH的部分病理特征,为后续疾病的深入研究提供模型。分子动力学模式实验进一步支持c.1675G>A(p.E559K)变异引起蛋白的稳定性减低,可影响蛋白与钙离子及其他分子的相互作用,导致蛋白质折叠错误,从而引起内质网应激,最终影响软骨细胞的存活。