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现代外科学的发展为骨折的治疗带来了新的理念和技术,但术后骨不连的发病率仍旧很高,因此骨折愈合的机制及影响因素仍有待于深入研究。成骨细胞在骨折愈合中扮演重要的角色,其增殖分化与骨折周围的微环境息息相关,因此,研究成骨细胞在骨折局部微环境中的反应有着非常重要的意义。自噬可避免细胞受外界不利环境的影响,是用来维持细胞内环境平衡与稳定的重要保护机制。研究表明,缺血、低氧和氧化应激等可导致自噬的发生。然而,骨折局部同样存在酸性的微环境,但是酸性微环境是否诱导成骨细胞发生自噬目前尚不清楚。因此,对成骨细胞所在酸性微环境中的自噬反应以及相关机制进行研究,可能为促进骨愈合以及骨折术后骨不连的防治提供新的思路。目的:本研究通过构建小鼠骨折模型,分析骨折断端周围能否发生自噬反应。通过体外细胞实验模拟骨折周围的酸性微环境,分析酸性环境对成骨细胞活力和凋亡的影响,以及酸性微环境下成骨细胞是否能发生保护性自噬反应,从而提高成骨细胞的存活率,为促进骨折愈合提供新的策略。方法:1.动物实验分组及方法实验选取27只体重在(30±10)g,6周龄雄性KM大鼠,并随机分为3组:A组(6h),B组(24h),C组(36h),每组9只。小鼠右侧股骨建立骨折损伤,左侧正常侧作为对照。A,B,C三组大鼠分别在骨折6h,24h,36h后处死,取下骨折及正常侧骨组织作为样本,样本固定、骨组织脱钙、石蜡包埋、切片,进行组织免疫荧光染色,检测标志蛋白LC3,p62的表达水平。2.细胞实验的分组及方法实验按pH的不同将培养基随机分为三组分别为pH 6.4、6.8(实验组)及7.4组(对照组)。成骨细胞培养在96孔板内,经过不同pH的培养基处理12h,24h,48h时间后,采用MTT比色法检测酸性微环境下成骨细胞的细胞活力;细胞在不同pH的培养基内处理24h后,采用AnnexinV-PI染色法检测不同pH培养基对成骨细胞凋亡的影响;细胞免疫荧光用来检测,经不同pH的培养基处理6h后,LC3在细胞内的表达;透射电镜观察pH 6.4的培养基处理6h后自噬小体的数量及其形态的变化;免疫蛋白印记法检测自噬标志蛋白LC3及p62的表达以及转化以及监测酸性微环境下成骨细胞自噬流的产生。通过添加自噬抑制剂CQ抑制成骨细胞自噬反应,检测不同pH培养基培养24h后细胞凋亡情况,分析酸性微环境下自噬对凋亡的影响。采用SPSS16.0软件包进行分析,单因素方差分析对数据进行统计。结果:1.动物免疫荧光观察显示:免疫荧光用来检测LC3及p62的表达。骨折组,骨折断端LC3的表达相比对照组要强(p<0.05),相反p62表达较对照组弱(p<0.05)。即骨折断端发生了自噬。2.MTT比色法显示:实验组(pH6.4、6.8)与对照组(pH7.4)相比,在各个时间点(12h,24h,48h)细胞活力均小于对照组(p<0.05),即酸性环境下成骨细胞的细胞活力受到抑制,与pH6.8组相比pH6.4组细胞活力更低,其差异具有显著性(p<0.05)。即酸性pH微环境对成骨细胞的细胞活力是不利的且呈pH及时间依赖性。3.AnnexinV-PI染色法显示:24小时后,pH6.4和pH6.8组细胞凋亡数目较正常组pH(7.4)明显增多,且pH6.4组细胞凋亡数最多。即酸性微环境促使成骨细胞凋亡,其差异具有显著性(p<0.05)。4.电镜观察显示:成骨细胞在酸性为pH6.4的培养液中培养6h后,自噬小体数目较正常组pH(7.4)明显增多,成骨细胞的形态结构发生了变化,呈双层膜包裹着细胞器或线粒体。即酸性环境可以诱导成骨细胞发生自噬反应。5.蛋白质免疫印记检测显示:pH6.4时,随着时间的延长(6h,12h,24h),LC3-Ⅱ/Ⅰ比值变低(p<0.05),而p62逐渐升高(p<0.05);即随着时间延长自噬减弱;6h时,随着pH的升高(pH6.4,6.8,7.4)LC3-Ⅱ/Ⅰ比值降低,相反p62逐渐升高(p<0.05),即酸性pH越低,自噬越强。在相同条件加入自噬抑制剂氯喹后,因其阻碍了自噬小体与溶酶体的结合,导致LC3-Ⅱ的表达明显增加。即随着时间的延长自噬减弱。6.细胞免疫荧光检测显示:细胞在pH6.4的培养液处理6h后,采用免疫荧光检测LC3,红色荧光分布在细胞质内,且随pH的升高,荧光表达降低(p<0.05)。说明酸性微环境可以促进自噬。7.加入自噬抑制剂后AnnexinV-PI染色法显:在相同的条件下,加入自噬抑制剂组比不加入抑制剂组细胞凋亡数明显增多(p<0.05)。即在酸性微环境下,抑制自噬,促进了成骨细胞凋亡。结论:1.体外实验发现酸性pH微环境对成骨细胞的细胞活力是不利的,它可以促进成骨细胞凋亡,并且诱导成骨细胞发生自噬。2.体内实验发现成骨细胞在骨折部位可发生自噬反应。3.成骨细胞通过自噬抑制细胞的凋亡,从而提高成骨细胞在酸性微环境中的的存活率。