【摘 要】
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目的:本研究对2型糖尿病小鼠进行为期8周的联合有氧-抗阻运动（联合运动）训练,探索联合有氧-抗阻运动对小鼠骨髓源内皮祖细胞（Endothelial Progenitor Cells,EPCs）的增殖、粘附、迁移和血管生成能力,以及PI3K、AKT和mi RNA-378a-5p的作用;并使用PI3K/AKT通路抑制剂作用于EPCs,进一步探究PI3K/AKT信号通路在EPCs功能和mi RNA-37
【基金项目】
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项目名称:抗阻运动通过Caveolin-1/PI3K/Akt调节2型糖尿病小鼠内皮祖细胞功能的机制研究，项目合同编号:81660147，项目来源:国家自然科学基金地区科学基金项目，项目起止时间:2017/01-2020/12
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目的:本研究对2型糖尿病小鼠进行为期8周的联合有氧-抗阻运动（联合运动）训练,探索联合有氧-抗阻运动对小鼠骨髓源内皮祖细胞（Endothelial Progenitor Cells,EPCs）的增殖、粘附、迁移和血管生成能力,以及PI3K、AKT和mi RNA-378a-5p的作用;并使用PI3K/AKT通路抑制剂作用于EPCs,进一步探究PI3K/AKT信号通路在EPCs功能和mi RNA-378a-5p中的调控作用,深入研究联合有氧-抗阻运动通过PI3K/AKT信号通路调控mi RNA-378a-5p对EPCs的增殖、粘附、迁移及血管生成功能的作用机制。方法:（1）动物模型为C57BL/KS.db背景的雄性db/db小鼠,8周龄大小,小鼠的随机血糖均超过300 mg/dl,购自南京大学-南京生物医药研究院[许可证号:SYXK（苏）2016-0012]。根据随机数字表法将小鼠随机分为联合有氧-抗阻运动组和对照组,每组各20只。对照组无运动训练;联合有氧-抗阻运动组小鼠的干预方式采用有氧运动与抗阻运动联合进行,每周进行6天的运动训练,即抗阻运动分别在周一、周三、周五进行,有氧运动在周二、周四、周六进行。两组小鼠在干预期间均按照平常饲养方式喂养。（2）经过8周的联合有氧-抗阻运动干预后,体外分离培养小鼠骨髓内皮祖细胞。提前采用纤维连接蛋白（FN-蛋白）将培养瓶包被,并将通过密度梯度法获取到的单核细胞转接到培养瓶中培养。采用免疫荧光染色法检测细胞表面标志物的表达进行鉴定细胞。（3）按照是否添加PI3K/AKT通路抑制剂将EPCs分组,其中对照组分离培养的细胞随机均分为对照组和对照+抑制剂组,联合有氧-抗阻运动组分离培养的细胞随机均分为联合运动组和联合运动+抑制剂组。使用PI3K/AKT通路抑制剂LY294002阻断EPCs的PI3K/AKT信号通路,观察各组EPCs的增殖、迁移、粘附及血管生成能力情况,Real-time PCR和Western blot检测PI3K、AKT和mi RNA-378a-5p的表达情况。结果:（1）细胞鉴定结果:EPCs表面标志物检测的阳性率结果显示,CD31为91.2±3.6%、CD34为95.3±2.6%、CD133为94.8±3.2%、CD144为93.1±4.2%、VEGFR2为95.8±2.5%,鉴定结果显示培养的细胞为EPCs。（2）2型糖尿病小鼠经过8周的联合有氧-抗阻运动训练,其骨髓EPCs的增殖、迁移、粘附及血管生成功能明显增强,与对照组相比差异具有统计学意义（P<0.05）。添加PI3K/AKT信号通路抑制剂LY294002后,联合运动+抑制剂组EPCs的增殖、迁移、粘附及血管生成功能较联合运动组明显下降,差异有统计学意义（P<0.05）。（3）与对照组相比,联合运动组EPCs PI3K、AKT m RNA及mi RNA-378a-5p的表达水平均升高,差异有统计学意义（P<0.05）。使用抑制剂LY294002阻断PI3K/AKT信号通路后,联合运动+抑制剂组EPCs的PI3K、AKT及mi RNA-378a-5p的m RNA表达水平较联合运动组降低,差异有统计学意义（P<0.05）。（4）经过8周的运动干预后,联合运动组EPCs的Phospho-PI3Kp85、Phospho-AKT蛋白表达水平显著提高,与对照组相比差异有统计学意义（P<0.05）。使用抑制剂LY294002阻断PI3K/AKT信号通路后,联合运动+抑制剂组EPCs的Phospho-PI3Kp85、Phospho-AKT蛋白表达水平较联合运动组降低,差异有统计学意义（P<0.05）。结论:（1）8周的联合有氧-抗阻运动对2型糖尿病小鼠骨髓EPCs的增殖、迁移、粘附及血管生成功能具有促进作用,同时可提高Phospho-PI3Kp85、Phospho-AKT蛋白和mi RNA-378a-5p的表达水平。（2）添加PI3K/AKT通路抑制剂可阻断PI3K/AKT信号通路,降低EPCs的Phospho-PI3Kp85、Phospho-AKT蛋白和mi RNA-378a-5p的表达水平,削弱联合有氧-抗阻运动对EPCs的增殖、迁移、粘附及血管生成功能的作用。（3）联合有氧-抗阻运动可能通过激活PI3K/AKT信号通路,上调mi RNA-378a-5p水平,进而增强2型糖尿病小鼠EPCs的功能,这进一步为联合有氧-抗阻运动促进EPCs增殖、迁移、粘附及血管生成功能,防治2型糖尿病患者血管并发症提供理论依据。
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