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目的:鉴定并筛选成功过表达Neuritin的转基因阳性鼠并从个体水平评价Neuritin蛋白在脑缺血再灌注损伤中对神经的保护和修复作用。方法:1.鉴定Neuritin转基因鼠(Nrn1-Tg)目的基因的整合及表达情况。(1)在基因组水平的鉴定:提取DNA通过PCR初步筛选成功整合插入序列的小鼠。用Southern blot对PCR阳性鼠进行再次鉴定,将上述两次检测为阳性的小鼠与野生型小鼠(WT)交配。(2)在转录水平的鉴定:用qRT-PCR检测Nrn1-Tg与WT鼠尾组织及海马组织的Neuritin mRNA的表达量。(3)蛋白水平的鉴定:用Western blot检测转基因鼠海马组织Neuritin蛋白的表达水平。2.用夹闭双侧颈总动脉的方法建立短暂性全脑缺血模型(Transient Global Ischemia,TGI)。36只C57BL6小鼠分为转基因模型组(Tg-TGI),非转基因模型组(WT-TGI),假手术组(sham),n=12。各组又分为再灌注1,3,7,14天四个亚组(n=3),分别在第1,3,7,14天处死小鼠对脑部组织取材。3.用qRT-PCR,Western blot及免疫组织化学检测海马组织中Neuritin在TGI模型后的时序表达谱。4.评估TGI后过表达的Neuritin对神经细胞损伤及凋亡的影响。(1)利用Nissl染色评价TGI模型后海马CA1区神经细胞的损伤程度。(2)免疫组织化学检测TGI模型后海马CA1区cleaved PARP1的表达量。(3)用Western blot检测TGI模型后海马组织中cleaved PARP1的表达量。5.检测过表达Neuritin对TGI后神经细胞再生修复能力的影响。(1)用免疫组织化学检测海马CA1区神经再生标志物:生长相关蛋白(GAP-43),突触素(SYN-38),神经丝蛋白(NF-200)的表达量。(2)用Western blot检测海马组织GAP-43,SYN-38,NF-200的表达量。6.评价过表达Neuritin对TGI后的空间学习和记忆能力的影响。用水迷宫实验检测TGI模型后Nrn1-Tg小鼠及WT小鼠的逃避潜伏期及穿越平台次数的差异。结果:1.成功鉴定过表达Neuritin的转基因阳性鼠。(1)基因组水平的鉴定:PCR筛选出的整合鼠与Southern blot鉴定结果一致,具有1-2个拷贝数。共繁殖小鼠145只,其中Nrn1-Tg鼠39只。(2)转录水平的鉴定:qRT-PCR结果显示,与WT小鼠相比,Nrn1-Tg小鼠尾组织及海马组织中Neuritin mRNA表达量显著升高(p<0.05)。(3)蛋白水平的鉴定:WB结果显示,与WT小鼠相比,Nrn1-Tg小鼠海马组织中Neuritin蛋白表达量明显升高(p<0.01)。2.在TGI模型后,Neuritin mRNA表达量在第1天逐渐上升,于第7天达到顶峰,在第14天回落。且在第1,3,7天,Tg-TGI组显著高于WT-TGI组(p<0.05)。WB及免疫组织化学结果显示,在TGI模型后,海马组织及CA1区的Neuritin蛋白表达量在第1天逐渐上升,在第3天达到顶峰后于第14天回落到第一天水平。与WT-TGI小鼠相比,在第3,7天,Tg-TGI组Neuritin蛋白表达量显著升高(p<0.05)。3.TGI后过表达的Neuritin可减轻神经细胞的损伤,挽救受损细胞免于凋亡。(1)Nissl染色结果显示,sham组海马CA1区神经细胞排列紧密,整齐。TGI模型组神经细胞数量减少,神经元显示出收缩的细胞体,紧缩的细胞核,提示造模成功。与WT-TGI相比,在第3天和第7天,Tg-TGI组的海马CA1区受损神经细胞数量显著减少(p<0.05)。在第14天,各组之间的神经细胞计数恢复至没有差异。(2)WB及免疫组织化学结果显示,在TGI模型后第一周,与WT-TGI组相比,Tg-TGI组海马组织及CA1区cleaved PARP1蛋白表达量显著降低(p<0.05)。在第14天时组间没有差异。4.过表达Neuritin可增强TGI后的神经细胞的再生修复能力。WB及免疫组织化学结果显示:(1)TGI模型后第1天GAP-43蛋白的表达量逐渐上升,至第3天达到顶峰后降低,且第3天和第7天Tg-TGI组的表达量显著高于WT-TGI组(p<0.05)。(2)SYN-38蛋白表达量在第1天逐渐上升,至第7天达到顶峰,随后于第14天出现回落,且第3天和第7天Tg-TGI组的峰值显著高于WT-TGI组(p<0.05),但在第14天,WT-TGI组的表达量高于Tg-TGI组。(3)与WT-TGI相比,Tg-TGI组的NF-200蛋白表达量在第1-7天显著升高(p<0.05),第14天组间没有差异。5.Neuritin可改善转基因小鼠TGI后的空间学习和记忆能力。(1)水迷宫实验结果显示三组小鼠随着训练次数增加,逃避潜伏期逐渐缩短。与WT-TGI组相比,第3,4,5天,Tg-TGI组的逃避潜伏期显著缩短(p<0.05)。(2)空间探索实验中,Tg-TGI组穿越平台次数及在目的象限探索时间相对于WT-TGI组显著增加(p<0.05)。(3)游泳探索路径也揭示Tg-TGI小鼠更有针对性的目的象限搜索策略,而WT-TGI小鼠倾向于随机游泳。结论:成功筛选并鉴定出过表达Neuritin的转基因阳性小鼠。过表达Neuritin可减轻神经细胞的损伤,并能通过抑制PARP1蛋白的降解,减少神经细胞的凋亡,加速了TGI后CA1区神经细胞的恢复。此外,在损伤后轴突再生的关键时期,上调的Neuritin还可显著上调损伤区神经细胞NF200、GAP-43及SYN-38蛋白的表达,为神经突起的再生和重塑提供了有利的微环境,有效提高TGI后的神经再生修复能力,加速TGI后小鼠的空间学习和记忆能力的改善。