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目的:课题组前期通过对食管鳞状细胞癌（Esophageal squamous cell carcinoma,ESCC）的全基因组测序,发现编码GDP-L-岩藻糖合成关键酶TSTA3基因在ESCC中的拷贝数显著扩增及高表达与淋巴结转移及患者的不良预后密切相关。细胞水平发现TSTA3可显著促进ESCC细胞侵袭迁移,本研究旨在前期工作基础上,进一步明确TSTA3在食管鳞癌中的作用及其介导的异常岩藻糖基化对食管鳞癌侵袭迁移的作用机制。方法:1、将前期构建成功的稳定过表达TSTA3的KYSE150细胞（TSTA3-WT）及阴性对照细胞（KYSE150-NC）,尾静脉注射入BALB/c-nu小鼠体内,利用小动物PET/CT成像技术观察小鼠体内部脏器转移瘤的情况,6周后采用过量注射2%戊巴比妥钠将其处死后,解剖学观察肝脏、肺脏转移瘤结节的数目、大小;同时采用HE染色技术进一步验证肿瘤的转移情况;从而确定TSTA3过表达在动物水平对ESCC转移能力的影响。2、应用LC-MS/MS技术进行N-糖蛋白组学及非标定量蛋白质组学研究,比较阴性对照和TSTA3过表达KYSE150细胞中N-糖蛋白和蛋白质总量的表达水平,采用0.75>概率标准对数据进行筛选,用蛋白定量组数据进行归一化后以去除蛋白表达量对修饰信号造成的影响,用于后续的生物信息学分析,经蛋白质组数据过滤后,进一步筛选糖蛋白中高度富集的N-糖基化位点。3、筛选稳定过表达TSTA3的KYSE150、KYSE450细胞及对应的阴性对照细胞,提取总蛋白后用UEA-I凝集素对α-1,2岩藻糖基化蛋白进行亲和富集,洗脱和冻干后,将富集的总岩藻糖基化蛋白溶解,与ESCC细胞一起添加到Transwell小室的上室,观察其侵袭能力的变化,然后利用α-L-岩藻糖苷酶处理岩藻糖基化蛋白后,观察其侵袭能力的变化是否逆转;同时采用UEA-I凝集素亲和富集印迹后,进行全凝胶内酶解消化,利用LC/MS/MS分析鉴定TSTA3-WT和NC组的差异蛋白;再将鉴定到的差异N-糖蛋白组学数据与凝胶质谱分析相结合,筛选TSTA3靶向的α-1,2岩藻糖基化蛋白。4、在KYSE150及KYSE450细胞中,将TSTA3-WT及NC组的细胞,提取总蛋白进行UEA-I凝集素亲和富集后再进行ERBB2的Western blot实验,观察TSTA3-WT组和NC对照组中的岩藻糖基化ERBB2水平和总ERBB2蛋白的表达的变化,同时在亲和层析实验体系中,加入不同浓度的L-岩藻糖,观察UEAI富集ERBB2蛋白水平是否受L-岩藻糖的影响。5、利用ERBB2免疫沉淀后的UEA-I免疫印迹观察NC与TSTA3-WT组中UEA-I凝集素与ERBB2蛋白的结合能力,同时观察PNGase处理后,UEA-I凝集素与ERBB2蛋白的结合能力的变化。6、在TSTA3-WT的ESCC细胞系中转染ERBB2特异性的小干扰RNA（small interfere RNA,si RNA）,观察敲低ERBB2是否可以逆转TSTA3过表达引起的促侵袭、迁移作用。7、糖基化抑制剂2-F-fuc处理TSTA3-WT的ESCC细胞后,利用Transwell检测ESCC细胞的侵袭和迁移能力变化,同时进行UEA-I凝集素富集,Western blot观察岩藻糖基化ERBB2和ERBB2总蛋白表达量。8、在TSTA3-WT的ESCC细胞系中转染靶基因ERBB2特异性的si RNA,Western blot验证干扰效率后,利用MTT法、克隆形成、Transwell、流式凋亡等实验检测ERBB2在ESCC细胞系中的功能。结果:1、两次独立的尾静脉注射转移瘤实验结果发现:小动物CT成像中TSTA3-WT组小鼠肺部转移病灶明显多于NC组;解剖学同样发现与NC组相比,注射TSTA3-WT组的小鼠身体状态较差,肺转移性结节较多,差异具有统计学意义（P<0.05）,HE染色亦得到进一步证实。2、经蛋白质组数据过滤筛选后,N-糖蛋白组学分析共鉴定出575个糖蛋白中的1100个N-糖基化位点,在这些糖蛋白中,与对照组相比,TSTA3过表达组共有37种糖蛋白上调,87种糖蛋白下调,最显著富集的基序是经典的N-糖基化序列:N-X-S。差异表达的糖蛋白主要富集于吞噬体、ECM受体、半乳糖代谢等通路。3、TSTA3-WT组中UEA-I凝集素富集的岩藻糖基化蛋白比NC组更能促进ESCC侵袭（P<0.05）,α-L-岩藻糖苷酶处理后,这种差异显著降低。4、质谱分析中鉴定的ERBB2进行UEA-I凝集素亲和富集后的Western blot显示:与转染NC的KYSE150和KYSE450细胞相比,TSTA3-WT中的ERBB2岩藻糖基化水平明显升高,而ERBB2的总蛋白表达量无差异;在反应体系中随着α-L-岩藻糖浓度的增加,被UEA-I凝集素富集的ERBB2含量也相应降低。5、ERBB2免疫沉淀后的UEA-I免疫印迹结果表明:与NC组相比,TSTA3-WT组UEA-I凝集素与ERBB2蛋白的结合显著增加,在每个条件的Input相等的情况下PNGase处理后的差异消失。6、在TSTA3过表达的ESCC细胞中敲低ERBB2,可以抑制TSTA3过表达所引起的促进ESCC细胞侵袭迁移的作用（P<0.05）。7、岩藻糖基化抑制剂2-F-fuc的处理可显著抑制ESCC细胞侵袭和迁移（P<0.05）。经2-F-fuc处理,UEA-I凝集素富集后,Western blot显示岩藻糖基化ERBB2水平显著降低,ERBB2总蛋白的表达水平没有差异。2-F-fuc一方面降低了ERBB2岩藻糖基化水平,另一方面降低了TSTA3蛋白的表达。8、MTT及克隆形成实验显示,在TSTA3过表达的ESCC细胞中,敲低ERBB2可显著减弱ESCC细胞的增殖和克隆形成能力（P<0.05）。流式凋亡结果展示:与对照组相比,ERBB2干扰组的早期和晚期凋亡率都较低,差异具有统计学意义（P<0.05）结论:1、TSTA3基因的过表达,可能通过促进ERBB2的α-1,2岩藻糖基化修饰,促进ESCC的侵袭转移。2、糖基化抑制剂2-F-fuc能够降低ERBB2的α-1,2岩藻糖基化修饰和TSTA3的蛋白表达,从而抑制了ESCC细胞的侵袭和迁移。