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体内的多数生理过程如转录和复制都涉及到蛋白质在DNA上的移动,这种移动过程将在DNA上导致扭力的形成,而扭力又能够反过来影响各种生理过程的进行,那么生理过程产生的扭力的传递就可以影响周边的生理过程的表达与调控。利用G-四链体能够在扭力作用下形成的特点,设计了以G-四链体为基础的扭力感应器。在具有形成G四链体能力的DNA链末端标记荧光,在其对应互补链末端标记相应淬灭基团,当无扭力传递,G-四链体未形成时,荧光发生能量共振转移被淬灭,而产生扭力后,G-四链体形成,使得荧光和淬灭基团空间距离加大,荧光共振能量转移消失,检测到荧光值上升。 在人类基因组中常见相邻的G-四链体形成序列,以及其他高级结构如十字花也在基因组中大量存在,因此利用这种基于G-四链体的感受器检测这些二级结构对扭力传递的影响。设计T7promoter,使用T7RNA聚合酶可以从此处转录产生扭力,使用G-四链体作为扭力感应器,在产生器和感应器之间设置不同的高级结构如G-四链体或十字花结构,以及蛋白质特异性结合位点测试了它们对扭力传递的影响,发现蛋白质-核酸的相互作用可以几乎截断扭力的传递,而高级结构则只是降低了扭力的程度。 鉴于扭力可以通过十字花结构,猜测扭力同样可以通过带有分岔的双链DNA,因此首先设计了具有三条臂的DNA链,其中一条臂上带有作为扭力产生器的T7启动子,另外两条臂上分别设计了以Fam和Tamra荧光区分的两个G-四链体扭力感受器,并在这两条臂上分别设置乳糖操纵子(LacO,对应Fam)与四环素阻遏蛋白结合位点(TetO,对应Tamra)。经过实验证明,在三岔链上转录引发的负超螺旋的扭力可以均等地分入两条臂中,引起G-四链体扭力感受器的反应,并且可以利用乳糖操纵子阻遏蛋白(Lac I)及其变构抑制剂异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)特异性地控制Fam荧光对应的G-四链体感受器所在臂上的扭力传递,而不影响Tamra对应的G-四链体感受器所在臂上的扭力传递。类似地也可以使用四环素阻遏蛋白(TetR)与其对应的抑制剂四环素(Tet)来独立控制Tamra荧光所对应的G-四链体感受器所在臂上的扭力传递而不影响另外一条臂。并且扭力的这种通过能力和特异性的控制可以扩展到具有四岔的DNA链。 由于此感受器仍然存在一些缺陷,如必须对DNA进行改造,需要DNA具有末端且只能在末端反应扭力的变化,还初步设计了具有发卡结构的探针,能够直接在不需要任何改造的DNA链内部检测负超螺旋产生的扭力的传递,并对这一探针做了简单的测试。 为了进一步拓展此系统的调控方式,还通过构建了基因缺陷型大肠杆菌菌株,初步筛选出了大肠杆菌中可能与G-四链体具有相互作用的RnHA(Rnase H A型)。 本文的发现一方面揭示了机械作用在体内的传递过程,以及可以受到蛋白质-核酸相互作用和高级结构的调控,以此来影响其他生理过程的进行。而扭力通过分岔链的能力,则意味着扭力不仅可以在单染色体内传递而影响周边的生理过程,还有可能在复制,重组等过程中实现跨染色体的调控作用。而生物材料作为纳米技术领域新兴的材料,所组建的纳米结构材料多为静态或相对静态,本文发现的这种机械力的传递和调控方式,为DNA在纳米技术中的应用新增了一种可以用于信号传递的新方式。