论文部分内容阅读
本研究以酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）为研究对象,先进行常规啤酒发酵试验,通过测定其发酵过程中的各项指标筛选到一株发酵性能优良的菌株ST-01,再通过筛选RAPD标记转化为SCAR分子标记。克服了RAPD标记的不稳定缺点,同时保留了RAPD标记的随机扩增多态性丰富、标记快速的优点,为探索酿酒酵母快速准确标记提供了方法和数据,同时也为生产企业保护其专利菌株提供了一个快捷、准确的方法。以发酵性能具有代表性的不同来源的共8株酿酒酵母进行啤酒发酵试验,比较了不同菌株在发酵过程中的各项指标。试验结果显示:发酵试验重复性较好,各项指标一致,其中ST-01菌株在啤酒发酵中具有凝聚性适中,产气能力强的感官优势;在发酵第8天出现双乙酰的峰值,其峰值为0.55 mg/L,后又以较快的速度发生双乙酰的还原,发酵结束时双乙酰的含量下降到0.05 mg/L左右,表明啤酒快速成熟;酒精含量高达4.536 g/100ml;发酵结束后发酵度达到了64.74%。而其他7株酿酒酵母的降糖能力远远小于ST-01菌株。相应的双乙酰和酒精含量的变化也显示这7株酵母的发酵性能低于ST-01菌株,预示ST-01是一株优秀的啤酒酿造菌种。将菌株ST-01和本实验室保藏的其他22株酿酒酵母菌株分别进行分子比较,寻找ST-01基因组特征序列作为分子标记。试用50条随机引物对23株酿酒酵母基因组DNA进行RAPD扩增,优化后的RAPD扩增体系为:模板DNA为120 ng,2.5mM Mg2+,Taq酶1U,200μM dNTPs,10pmol随机引物,反应总体积为25μL;PCR热循环参数为93℃2 min,36℃1 min,72℃2 min 1次循环;93℃1 min,36℃1 min 72℃2 min,40次循环;93℃1 min,36℃1 min,72℃10 min 1次循环,筛选到P09和P46两条随机引物对ST-01菌株具有较好的特异性。P09可以从2.412,ST-01,SK-26,ZD-01四株酿酒酵母基因组DNA中稳定扩增出长度为433bp的SCAR-Sc433片断;P46可以从2.1882,ST-01,NJ-02三株酿酒酵母基因组DNA中稳定扩增出长度为665bp的SCAR-Sc665片断。供试菌株中仅有ST-01能稳定的具有这两个扩增片段。对这两个片断进行回收后连接到pUCmT质粒载体,导入大肠杆菌DH-5α中,筛选阳性克隆,酶切鉴定后的质粒经过测序根据序列设计了2对特异性引物,建立了PCR方法检测SCAR-Sc433和SCAR-Sc665片段,结果表明ST-01可以特异性的扩增出这两个DNA片段,显示了ST-01与其他菌株的分子差别。本研究将SCAR-Sc433和SCAR-Sc665特征核酸序列作为ST-01菌株的分子标记为该菌株的生产应用以及进一步的改良育种奠定了基础。