论文部分内容阅读
目的有研究报道Toll样受体9(Toll-like receptor 9,TLR9)的表达可能与包括过敏性鼻炎(Allergic rhinitis,AR)在内的Th2(T helper type 2,Th2)型过敏性炎症有关。但关于TLR9在AR患者嗜碱性粒细胞中的表达情况却知之甚少。因此本研究检测过敏原激发前后AR患者外周血嗜碱性粒细胞、KU812细胞和致敏小鼠外周血嗜碱性粒细胞中的TLR9表达,以期为嗜碱性粒细胞TLR9在AR发病机制中的作用研究提供实验数据。方法1.人外周血嗜碱性粒细胞激发试验:募集23名健康志愿者和46名AR患者外周血标本,流式细胞术检测屋尘螨过敏原提取物(Dermatophagoide allergen extract,DAE)、大籽蒿过敏原提取物(Artemisia sieversiana wild allergen extract,ASWAE)和梧桐花粉过敏原提取物(Platanus pollen allergen extract,PPAE)激发前后人外周血嗜碱性粒细胞中TLR9的表达。2.KU812细胞培养及激发实验:用ATCC标准RPMI 1640培养基培养KU812细胞。用不同浓度的屋尘螨重组蛋白(Dermatophagoides Pteronyssinus 1,Der p1)、卵清白蛋白(Ovalbumin,OVA)、TLR9配体(CpG)、白介素-31(Interleukin-31,IL-31)、IL-33、IL-37、胸腺基质淋巴细胞生成素(Thymic stromal lymphopoietin,TSLP)、健康人血浆、DAE、ASWAE和AR患者血浆刺激KU812细胞30 min、2 h和16 h,收集细胞和上清。一部分细胞用于流式细胞术检测TLR9表达变化,一部分细胞重悬于Trizol中进行qPCR检测TLR9 mRNA表达变化;上清用于ELISA检测IL-4,IL-6和IL-13等细胞因子水平。3.小鼠致敏及激发实验:随机挑选14只小鼠,致敏组和非致敏组各7只,致敏组分别于第0、7、14、21天皮下多点注射OVA加氢氧化铝佐剂,非致敏组在同一天注射相同体积的生理盐水(Normal saline NS),第28天,对小鼠进行滴鼻激发,致敏组双侧鼻腔滴入1%OVA各10μl,非致敏组滴入相同体积的NS,连续滴鼻7天,最后一天滴鼻后,等待3 h后处死动物,收集血液用于流式细胞检测嗜碱性粒细胞中TLR9的表达情况。结果1.流式细胞术检测AR患者外周血嗜碱性粒细胞中TLR9+百分比和平均荧光强度(Mean fluorescence intensity,MFI)表达结果:AR患者粒细胞群中TLR9+CCR3+细胞的百分比表达较健康对照组(Healthy control,HC)增高46%,而在单个核细胞群(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)中TLR9+CCR3+(Chemokine CCR receptor3,CCR3)细胞的百分比无显著差异。DAE和PPAE激发后,AR患者粒细胞群中TLR9+CCR3+细胞的百分比表达较静息状态分别增高76%和84%。DAE和PPAE激发后,在粒细胞群和PBMC群中,AR患者TLR9+CD123+HLA-DR-(Human Leukocyte Antigen-DR,HLA-DR)和TLR9+CCR3+CD123+HLA-DR-细胞的比例均明显增高。2.KU812细胞激发实验结果显示:CpG可诱导KU812细胞TLR9表达增强,IL-37、IL-31、IL-33、ASWAE和DAE可诱导KU812细胞中TLR9 mRNA表达增强并且释放IL-6水平升高;OVA和Der p1诱导KU812细胞释放IL-13水平升高。3.OVA致敏的小鼠血液中嗜碱性粒细胞中TLR9+百分比表达升高,与对照组相比,OVA致敏小鼠血液嗜碱性粒细胞中TLR9的百分比表达明显增高。结论本研究首次发现AR患者外周血嗜碱性粒细胞中TLR9的表达增强;多种过敏原及炎症因子可以诱导KU812细胞释放IL-6和IL-13水平上调;过敏原可以诱导AR患者和致敏小鼠血液嗜碱性粒细胞中TLR9的表达上调。本研究结果提示嗜碱性粒细胞可能通过TLR9参与AR的病理生理过程。