研究背景动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)是一种慢性进展性的炎症疾病,是导致缺血性脑卒中的主要原因之一。一般认为,AS以血管内皮功能损伤为起始事件,随着脂质沉积、泡沫细胞形成,逐渐发展为动脉粥样硬化斑块,最终引起血管闭塞事件发生。除内皮损伤外,内膜下的氧化应激学说得到越来越多的关注。氧化应激是指机体受有害刺激时,氧自由基的产生与清除失衡,致使活性氧(reactive oxygen species, ROS)在体内大量蓄积导致组织和细胞损伤的过程,是AS进展的重要机制之一。目前,亲环素A(Cyclophilin A, CyPA)与氧化应激、动脉粥样硬化的关系引起了诸多学者的关注。CyPA属亲免素蛋白家族成员,是重要的氧化应激诱导因子,在AS病变过程中,由内皮细胞、血管平滑肌细胞以及单核巨噬细胞分泌。有研究探讨了血清CyPA浓度与急性冠脉综合征(ACS)的关系,发现ACS患者血清CyPA浓度明显高于非冠脉综合征患者血清水平,升高的Cyl浓度可能是ACS严重程度的预测指标。KLF2是一种转录因子,在大鼠血管中具有内皮屏障功能,可通过调节eNOS表达诱导血管舒张因子NO生成,维持血管内皮完整及张力调节。我们前期的研究显示：高脂饮食喂养的大鼠机体在氧化应激状态下刺激血管壁分泌CyPA水平升高,通过CyPA/KLF2/eNOS这一机制诱导血管舒张因子NO生成减少,导致血管内皮舒张功能损伤,启动AS病变的发生。在课题的研究进程中发现,亲环素A高表达不单破坏血管内皮舒张功能,而且明显诱导血管内皮炎症反应,管壁炎性细胞增生明显,内皮炎性反应活跃,且随着动脉粥样硬化病变程度加重,炎性细胞增生明显、亲环素A表达增加。由此推测,在氧化应激状态下CyPA可能通过某种机制介导血管内皮炎性反应,导致AS的发生发展。糖尿病(diabetes mellitus, DM)是多种因素引发的一组胰岛素分泌不足或胰岛素抵抗为特征并伴有高血糖相关并发症的代谢性疾病。长期高血糖状态可通过葡萄糖自氧化、蛋白质的非酶促糖基化、线粒体氧化磷酸化及抗氧化系统清除能力减弱等机制导致机体氧化应激增强。糖尿病患者多数死于长期高血糖引起的大血管、微血管及神经损伤等血管并发症,并且糖尿病患者脑动脉粥样硬化病变更为明显,多发性脑动脉狭窄发生率显著增加,是影响糖尿病患者健康的主要危险因素。但是CyPA是否参与糖尿病引起的动脉硬化进展,目前尚少见报道。本研究旨在探索CyPA对血管内皮功能障碍、动脉粥样硬化病变及糖尿病动脉粥样硬化病变的作用及机制。研究目的本研究旨在明确：1.亲环素A在大鼠动脉粥样硬化进展中的作用及其信号传导机制；2.亲环素A在糖尿病大鼠动脉粥样硬化病变中的作用及其机制。方法1.动脉粥样硬化大鼠建模：40只SPF级雄性Wistar大鼠,随机分为4组,分别为对照组,动脉粥样硬化8周组(AS 8W组),动脉粥样硬化12周组(AS 12W组),动脉粥样硬化16周组(AS 16W组),每组10只。AS组大鼠给予高脂饲料喂养,并在高脂饲料喂养第二天给予一次性腹腔注射维生素D3注射液60万IU/kg,继续高脂饲料喂养。对照组给予基础饲料,腹腔注射等量生理盐水。2.糖尿病动脉粥样硬化模型建立：糖尿病组(DM组)10只大鼠腹腔注射维生素D3注射液60万IU/kg,并给予高脂饲料喂养4周后,禁食12小时,尾静脉测空腹血糖,称体重,按50mg/Kg一次性腹腔内注射1%链脲佐菌素,注射后1小时给充足饮水及食物,空白对照组及AS组给予腹腔注射等量柠檬酸缓冲液。造模2天后,进行经腹腔注射葡萄糖耐量试验(IPGTT),空腹血糖≥7.0mmol/L,腹腔注射葡萄糖后2h血糖mmol/L表明造模成功。继续高脂喂养至16周,8只大鼠造模成功。3.体重及血糖监测：糖尿病造模2天后行腹腔注射葡萄糖耐量试验(IPGTT),筛选糖尿病模型。每周监测各组大鼠体重、测尾静脉血糖变化。4.各组大鼠血脂、血清胰岛素及炎性因子水平检测：依据造模方式不同,采用ELISA技术分别检测血胆固醇(CHO)、甘油三酯(TG)、氧化性低密度脂蛋白(ox-LDL)、血清胰岛素、C反应蛋白(CRP)、白介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-a (TNF-a)及血管细胞粘附因子-1(VCAM-1)的水平。5.血管内皮依赖性舒张功能测定：依据各造模时间下,随机选取每只大鼠3段动脉环在离体恒温器官灌流系统中行离体血管环内皮依赖性舒张功能测定。6.腹主动脉HE染色和血管斑块横断面积及内中膜厚度测定：取腹主动脉标本、石蜡包埋、切片及苏木素-伊红染色。测定各组大鼠腹主动脉内中膜厚度(Abdominal aortas intima-media thickness, IMT)及粥样硬化斑块横断面积与管腔面积百分比。7.腹主动脉斑块信号蛋白的测定：免疫组化染色检测血管壁CyPA、 p-ERK1/2蛋白量和平均光密度。蛋白印迹技术测定血管壁CyPA、p-ERK1/2及NF-kB表达变化及灰度值。统计学分析数据采用SPSS21.0进行统计分析。计量资料用均数±标准差(x±SD)描述。多组均数间比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA),组间多重比较采用最小显著性差异t (LSD-t)检验。P<0.05为差异有统计学意义。结果一、亲环素A对大鼠动脉粥样硬化病变作用及其可能机制1.40只大鼠实验结束前无死亡,成功建立动脉粥样硬化模型。2.各组大鼠体重、血脂及血清炎性因子测定高脂饮食诱导的动脉粥样硬化大鼠体重增长缓慢,随造模时间的延长,大鼠毛色泛黄,饮食量减少。与对照组相比,动脉硬化大鼠血胆固醇、甘油三酯及氧化性低密度脂蛋白含量均显著增加(均P<0.05, AS 8W组、AS 12W组、AS 16W组比对照组)；且随高脂饮食造模时间延长,血脂逐渐升高,组间差异有统计学意义(均P<0.05,AS 8W组、AS 16W组比AS 12W组)。各组大鼠血清炎性因子检测结果显示,动脉硬化大鼠血清中CRP、IL-6、TNF-a及VCAM-1等炎性因子较对照组大鼠明显升高(均P<0.05,AS 8W组、AS 12W组、AS 16W组比对照组)；动脉粥样硬化组间比较显示,血清炎性因子在8W组、12W组、16W组中含量逐渐增高,差异均有统计学意义(均P<0.05,AS 8W组、AS 16W组比AS 12W组)。3.动脉粥样硬化大鼠血管内皮依赖性舒张功能显著降低检测各组大鼠腹主动脉血管环在乙酰胆碱浓度梯度下(1×10-9-1×10-4mol/L)舒张反应。结果显示,对照组大鼠腹主动脉血管环在乙酰胆碱浓度梯度下内皮舒张功能良好,最大舒张功能达(99.73±3.85)%。与对照组相比,高脂饮食的AS组大鼠血管环在乙酰胆碱浓度梯度下的内皮舒张功能均明显下降(P<0.05,AS8W组、AS 12W组、AS 16W比对照组)。AS 8W组、AS 12W组及AS 16W组间比较,结果提示在各浓度梯度下随动脉硬化造模时间延长,大鼠血管环内皮依赖性舒张率逐渐下降,组间差异有统计学意义(P<0.05, AS 8W组比AS 12W组;P<0.05, AS 16W组比AS 12W组)；尤其在高脂喂养第8周前后血管环内皮舒张率下降速度明显,第12周与16周后血管内皮依赖性舒张功能下降相对平缓。4.各组大鼠腹主动脉HE染色结果及血管壁动脉硬化斑块面积及内中膜厚度比较空白对照组大鼠主动脉内皮完整,内皮细胞和平滑肌细胞排列整齐；动脉硬化组大鼠动脉内皮完整性损伤,可见内皮细胞凋亡,平滑肌细胞层增生、迁移,炎性细胞浸润,弹性纤维断裂,粥样斑块、钙化斑形成。各组大鼠腹主动脉HE染色显示管壁斑块病变逐渐加重。与对照组相比,随着高脂饮食造模时间延长,大鼠腹主动脉血管壁内中膜厚度及斑块横断面积与管腔面积百分比逐渐增加,组间差异有统计学意义(均P<0.05,AS 8W组、AS 12W组、AS 16W比对照组；均P<0.05,AS 8W组、AS 16W比AS 12W组)。5.大鼠腹主动脉CyPA、p-ERK1/2及NF-kB蛋白表达水平比较免疫组化染色结果显示,各组大鼠腹主动脉血管壁内CyPA、p-ERK1/2表达存在明显差异。与对照组相比,动脉硬化组大鼠管壁CyPA、p-ERK1/2表达显著增加,且随着造模时间延长呈显著递增趋势,组间差异有统计学意义(P<0.05,AS 8W组、AS 12W组、AS 16W比对照组；P<0.05,AS 8W组、AS 16W组比AS 12W组)。Western-blot技术检测结果表明,血管壁亲环素A、p-ERK1/2及NF-kB蛋白表达随造模时间延长呈显著递增趋势,组间差异有统计学意义(均P<0.05, AS8W组、AS 16W组比AS 12W组)。二、糖尿病通过促进亲环素A的表达加重大鼠动脉粥样硬化病变1.糖尿病大鼠食量减少,消瘦,多饮多尿,精神差,共8只大鼠糖尿病造模成功。2.糖尿病大鼠血清胰岛素水平显著减少而炎性因子水平升高与对照组相比,单纯高脂喂养的动脉粥样硬化大鼠体重增长相对缓慢,而糖尿病大鼠多消瘦,体重下降明显。对照组与动脉硬化组大鼠血糖及血清胰岛素水平差异无统计学意义(均P>0.05)；糖尿病大鼠血糖水平显著升高,胰岛素水平明显下降,差异有统计学意义(均P<0.05,AS组、对照组比DM组)。与AS组相比,糖尿病进一步增高动脉粥样硬化病变大鼠血中炎性因子水平,差异有统计学意义(P<0.05,DM组比AS组)。3.糖尿病加重大鼠腹主动脉粥样硬化斑块病变空白对照组大鼠主动脉内皮完整,内皮细胞和平滑肌细胞排列整齐；AS组大鼠动脉内皮完整性损伤,可见内皮细胞凋亡,平滑肌细胞层增生、迁移,炎性细胞浸润,弹性纤维断裂,粥样斑块形成。DM组大鼠腹主动脉血管内皮严重损伤脱落,整个血管壁可见明显钙化斑,弹性纤维断裂,病变严重。4.糖尿病增加腹主动脉壁CyPA、p-ERK1/2及NF-kB蛋白表达免疫组化染色结果显示,与AS组相比,糖尿病动脉硬化大鼠管壁CyPA, p-ERK1/2表达显著增加,组间差异有统计学意义(P<0.05,DM组比AS组)。Western-blot技术检测结果显示,糖尿病诱导动脉粥样硬化大鼠血管壁CyPA, p-ERK1/2和NF-kB蛋白表达水平较单纯动脉硬化大鼠进一步显著增加,差异有统计学意义(P<0.05,DM组比AS组)。结论高脂饮食诱导大鼠血脂及血清炎性因子水平升高,机体慢性炎症反应及氧化应激介导CyPA的高表达,可能通过CyPA- p-ERKl/2-NF-kB信号通路促进动脉粥样硬化的发生发展。糖尿病诱导CyPA、p-ERK1/2及炎性转录因子NF-kB在动脉粥样硬化斑块中更为显著表达,加重血管动脉粥样硬化斑块病变。由此认为糖尿病可能通过增加CyPA蛋白表达,促进p-ERK1/2及NF-kB信号传导加重动脉粥样硬化病变程度。