大豆转录因子GmPIF1基因的克隆及功能验证

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大豆是我国种植最广泛的经济作物之一,是世界上重要的油料作物,具有丰富的营养价值和较高的经济价值。光信号是保障大豆正常生长发育的重要环境因素。光敏色素(Phys)通过在植物体内感知光信号后,与光敏色素互作因子(PIFs)相互作用从而调节植物生长发育。PIFs在植物中不仅能够整合光信号传导,也参与激素信号转导,在植物生长发育过程中也起着十分重要的作用。目前,有关PIFs的研究在拟南芥中相对透彻,大豆中对GmPIFs基因家族的研究比较少。本研究,从大豆品种吉林32中克隆GmPIF1转录因子,并对它进行了结构分析和功能验证,分析结果如下:1.利用RT-PCR的方法从大豆品种吉林32中克隆GmPIF1基因的CDS,全长1530bp,编码510个氨基酸,含有APA、APB和bHLH保守结构域结构域,属于bHLH转录因子家族,亚细胞定位预测在细胞核中。2.利用实时荧光定量PCR技术,研究了GmPIF1基因在大豆不同组织中的表达情况,结果表明,GmPIF1在根、茎、叶、花、20d、30d、50d胚中均有表达,且表达量表现为叶>花>50d胚>根>30d胚>茎>20d胚。3.通过将原核表达重组质粒pET28a-GmPIF1转入大肠杆菌Rosetta,经IPTG诱导后,SDS-PAGE电泳结果显示,GmPIF1蛋白能在原核系统中能高效表达。4.通过将亚细胞定位重组质粒pHB-GmPIF1-YFP转入农杆菌EHA105,注射法转化烟草下表皮细胞,经荧光显微镜观察黄色荧光结果显示,GmPIF1定位于细胞核。5.通过将酵母自激活验证重组质粒PGBKT7-GmPIF1转入酵母菌AH109,在缺陷培养基上的生长情况结果显示,GmPIF1蛋白在酵母系统中不具有转录自激活活性。6.通过酵母双杂交实验结果显示,GmPIF1蛋白在不同光处理下能与拟南芥AtPhyA、AtPhyB和大豆GmPhyA、GmPhyB的光敏色素蛋白相互作用。7.通过将植物表达载体重组质粒pCHF3300-GmPIF1转入农杆菌EHA105,花序侵染法侵染拟南芥,获得T3代GmPIF1转基因拟南芥纯合体。对野生型、突变体和转基因拟南芥进行了红光和远红光处理,并对萌发率、萌发相关基因表达量以及GA、ABA的含量进行了测定,结果显示,GmPIF1通过响应PhyB依赖的红光和PhyA依赖的远红光来调控种子萌发相关基因,从而调节GA和ABA的含量,进而实现对种子萌发的调控。
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